成果简介
近日，香港科技大学曾超华团队和内华达大学Eakalak Khan在环境领域著名学术期刊Environmental Science & Technology上发表了题为“Facilitating intracellular electron bifurcation by mediating flavins-based extracellular and transmembrane electron transfer: A novel role of pyrogenic carbon in dark fermentation for hydrogen production”。热解碳被认为是暗发酵制氢的增强剂，但人们对热解碳如何调节细胞外电子转移并影响跨膜呼吸链和细胞内代谢知之甚少。这项研究解决了现有的知识空白，并证明由木材废料制成的热解碳可以显着提高暗发酵制氢性能，添加800℃热解产生的热解碳（PC800）使氢气产量增加369.7%。生化定量、电化学分析和电子呼吸链抑制测试表明，PC800促进了细胞外基于黄素的电子传递过程，并进一步激活了跨膜电子传递的加速。宏基因组/宏转录组对比分析表明，Rnf复合物是与PC800介导的胞外电子转移相关的潜在跨膜呼吸酶。基于NADH/NAD+循环，促进的Rnf复合物可以刺激电子分叉Etf/Bcd复合物的功能和糖酵解的启动。而Etf/Bcd复合物的增强可以进一步有助于平衡糖酵解反应的NADH/NAD+水平，同时为A1组[FeFe]氢化酶提供还原的铁氧还蛋白。这种质子-能量联动机制可以实现ATP和氢气的耦合生产。这项研究验证了热解碳在介导胞外电子传递和跨膜/细胞内途径中的重要作用，并揭示了电子分叉在暗发酵制氢中的关键作用。
引言
厌氧消化通过微生物将有机物转化为甲烷和二氧化碳，分为水解、酸化、乙酸化和产甲烷四步。本文主要研究酸化阶段的暗发酵过程，发酵细菌在该过程中将有机废物转化为氢气和其他增值产品。由于操作简便且反应周期短，暗发酵被广泛用于处理富含碳水化合物的废水和有机废物，但其在能源生产中的应用受到产氢效率低的限制。研究表明，胞外电子传递（EET）是影响暗发酵性能的关键因素。热解碳材料因其经济友好、生物相容和电活性，能够促进微生物的EET，增强跨膜电子传递和细胞代谢，从而提高能量获取和底物消耗。在暗发酵过程中，细菌通过释放多余电子产生氢气，但由于缺乏共生伙伴吸收氢气，暗发酵体系内氢分压较高，限制了底物氧化反应的进行。因此，深入理解氢气释放与发酵微生物群落内能量获取的关系至关重要。本研究通过电化学测试、生化定量及多组学分析，探索热解碳在暗发酵中促进电子传递、提升能量回收效率的作用，为提高氢气产量提供新见解。
图文导读
图1. 热解碳对暗发酵性能的影响：（a）不同条件下氢气产量的变化；（b）不同条件下的VFA浓度；（a）Spearman 等级相关矩阵显示氢气产量和热解碳性质之间的相关性
图1（a）显示热解碳的添加促进了氢气产量，与对照反应器相比，添加PC800的反应器的最终氢气产量增加了369.7%。此外，所有反应器的VFA组成中醋酸（20.7-10.6%）和丁酸（32.8-68.7%）均占主导地位，表明梭菌型发酵可能发挥着关键作用。
图2. PC800在增强暗发酵体系中电子转移方面的作用：（a）计时安培法i-t测试；（b）黄素和c-Cyts的浓度；（c）电子呼吸链抑制结果；（d）核黄素氧化还原的电子转移速率；（e）PC800增强黄素基电子转移的机制
为了研究热解碳（PC800）在暗发酵制氢体系中的作用，对添加PC800的菌群进行了分析。从图2（a）可以看出，PC800的加入使最大电流增加了47.8-87.1%，证明其促进了胞外电子传递。图2（b）显示PC800的加入不仅增强了胞外聚合物（EPS）中的游离核黄素浓度，还增加了胞内黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的含量，这两种物质在跨膜电子传递中起重要作用。进一步结合图2（c，d）的结果，可以推测PC800增强了核黄素的电子传递速率，提升了跨膜电子传递的效率。
图3. 电子载体浓度和酶活性的变化：（a）Etf的浓度以及Bcd和氢化酶的活性；（b）电子分叉Etf/Bcd复合物的机制；（c）ATP和铁氧还蛋白浓度；（d）NAD+和NADH的浓度，以及NADH/NAD+比率
热解碳在促进乙酸和丁酸发酵途径的作用已经得到验证（见图1（b））。最近的一项研究显示，在丁酸发酵过程中，电子转移黄素蛋白（Etf）和丁酰辅酶A脱氢酶（Bcd）之间存在一种新颖的耦合机制，被称为Etf/Bcd复合物。图3（a）显示，PC800组的Etf水平和Bcd活性显著增加，表明PC800激活了电子分叉。如图3（b）所示，Etf可以催化两个电子从NADH氧化（E0' = –320 mV）中分叉，其中一个电子通过Bcd传递给巴豆酰辅酶A（E0' = –10 mV），而另一个则传递给铁氧还蛋白（Fd）或黄素氧还蛋白（E0' = –10 mV）。这一电子分叉过程（ΔG = –44 kJ/mol）能够节省更多的能量，相较于传统的基于NADH的产氢途径（ΔG = +21 kJ/mol），前者能更稳定地促进氢气的释放。因此，在前15小时内，PC800组的氢化酶活性、ATP浓度和铁氧还蛋白浓度均显著高于对照组（见图3（b，c））。同时，这种模式的促进使得PC800组的NAD水平更加稳定，有利于细胞代谢（见图3d）。
图4. 宏基因组和宏转录组对比分析：（a）宏基因组和宏转录组数据集的相关基因、转录本丰度和表达水平；（b）PC800介导的呼吸链机制；（
c）宏转录组数据集的微生物属中电子分叉复合物的分布；（d）不同活性的氢化酶的基因、转录本丰度和表达水平
宏基因组和宏转录组的对比分析揭示了微生物群落的功能和基因表达水平。图4（a）显示，Rnf复合物的基因在PC800组中被积极表达，说明其在生成质子梯度以促进ATP合成方面的重要性。同时，PC800组的Etf/Bcd基因转录丰度显著提升，进一步证明了电子分叉的关键作用。即使在发酵的6小时初期，能量代谢相关酶的转录上调也表明热解碳在增强呼吸电子转移过程中的潜力。图4（d）显示，添加PC800后，[FeFe]-氢化酶的转录丰度在第15小时显著增加。PC800组中氢化酶的多样性和不同亚群的活性得到了体现，特别是A1组[FeFe]氢化酶，它通过铁氧蛋白循环与Etf/Bcd复合物相互关联，促进了氢气的释放。而C2和C3组氢化酶的转录丰度在15小时内也明显高于6小时，这可能与氢气水平的变化有关。
小结
低效的细胞外电子转移效率一直是限制暗发酵性能的主要障碍。因此，本研究引入热解碳到暗发酵体系中，成功实现了高效的氢气生产。研究揭示了热解碳对细胞外黄素电子传递过程的影响，并通过生化分析和多组学分析技术深入探讨了热解碳促进暗发酵制氢的机制。总体来看，热解碳的加入有助于加速基于黄素的细胞外电子转移，并增强了ATP和氢气释放之间的耦合。本研究结果表明，热解碳显著促进了电子分岔，使其成为微生物获取能量的主要方式。考虑到电子分叉相较于传统能量收集方法的优势，热解碳强化的暗发酵有望成为一种低能量输入、高产氢率的废物增值技术。
作者简介
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