一文读懂Western blot易错点：科研实践中的关键解决方案
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科学
2024-07-12 07:30
北京
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在蛋白质电泳和转膜实验中，有许多细节和注意事项容易被忽视，这些细节往往决定了实验的成败。本文将详细介绍胶的凝固时间、定时器的使用、梳子的选择以及免疫印迹膜的预处理等关键操作要点。同时，针对电泳和转膜过程中常见的问题，我们也提供了相应的解决方案。通过掌握这些要点和注意事项，可以有效提高实验的成功率，减少实验失败的风险。希望这篇文章能为您的实验提供实用的参考和指导。
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温度高有利于胶凝固，如果需要加快该过程，可以将其置入37℃恒温箱，也可以增加TEMED的体积，例如配制1块10%的胶需要加入TEMED的体积为2μl，可以增加到4μl，甚至到8μl，不过操作者需要比较小心，因为TEMED是促凝剂，当浓度高时，凝固时间较短，若操作不熟练，也许会出现胶液还没有加完，就已经凝固在小烧杯中的情况。
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硝酸纤维素膜（NC膜）的预处理：需用转膜缓冲液润湿膜；硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力地结合在一起。硝酸纤维素膜很脆，易破。根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。通常大于20KD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20KD的蛋白就可以用0.2μm了，如果用0.45μm的膜就会发生转移到膜反面或穿过膜的现象。PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）的预处理：在转膜前需要进行激活；具体操作就是将膜浸入甲醇溶液中10秒，而后在转移缓冲液中浸泡10-15分钟，以除去甲醇。因为PVDF膜是疏水性的，在转膜缓冲液里很难浸透，甲醇处理后使其更容易浸润，且甲醇处理活化的PVDF膜上的正点基团，使它更容易与带负电的蛋白结合。
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电泳架置于电泳槽中，原则是“红对红，黑对黑”，电极上红色代表正极，黑色代表负极，若正负极弄反，样品就不向下向胶里跑，而是往上向溶液中跑，导致实验失败。
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操作者务必配备定时器，若电泳时蛋白质条带跑出胶下缘，则无法得到需要的条带，导致实验失败。![]()
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梳子的厚度与玻璃板的厚度相一致，常用的为1.0mm的梳子，若上样体积较大，可以选择1.5mm的梳子；再根据样品的数量选择不同孔的梳子，如10孔/15孔。SDS-PAGE胶浓度不合适，调整胶浓度，分子量大的用低浓度的胶，分子量小的用高浓度的胶电泳时蛋白质上样量过高，需要减少电泳时的蛋白质上样量目的蛋白有多个修饰位点，需要查阅文献或进行生物信息分析，通过去修饰确定蛋白的实际大小目的蛋白有其他剪切本，需要查阅文献或进行生物信息学分析可能性样品提取过程中目的蛋白降解，在提取样品时加入蛋白酶抑制剂；处理样品时在冰上操作一抗浓度过高，通过降低抗体浓度，可以减少非特异性条带蛋白等电点等于或接近转膜缓冲液的pH值，可尝试使用CAPS缓冲液转膜时间不够，对于厚的胶和高分子量蛋白需要延长转膜时间一抗与二抗不匹配，订购试剂时认真选取一抗与组织种属蛋白转膜不充分，转膜后使用丽春红检测效果，利用预染marker检测转膜效果；检查转膜时装配及方向是否正确，膜需要保持湿润目的蛋白量过少，提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂一抗失效，使用有效期内抗体，分装保存，避免反复冻融取用，工作液现用现配二抗上标记的酶失效，使用不含有叠氮化钠的溶液或容器，因为叠氮化钠会抑制HRP活性发光底物失效，可将底物与酶标抗体混合，观察是否显影，如未显影可能是底物或是酶标抗体失效蛋白降解，转膜温度过高；试剂中的某些成分使蛋白降解抗体浓度过高，抗体浓度过高会产生高背景，尝试降低抗体浓度
