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哺乳动物细胞的定向进化为推进合成生物学的应用提供了一种强有力的方法。然而，现有的基于哺乳动物的定向进化方法面临着实质性的瓶颈，包括宿主基因组干扰、小文库大小和不受控制的诱变。2025年1月3日，北京大学林一瀚团队在Nature Chemical Biology（IF=13）在线发表题为“Orthogonal RNA replication enables directed evolution and Darwinian adaptation in mammalian cells”的研究论文，该研究设计了一个正交甲病毒RNA复制系统，以进化基于RNA的设备，使RNA复制酶辅助的持续进化(REPLACE)能够在增殖的哺乳动物细胞中进行。该系统通过复制酶限制的复制模式和诱导型诱变产生一个大的、持续多样化的复制RNA文库。使用REPLACE，设计了荧光蛋白和转录因子。值得注意的是，配备REPLACE的细胞可以经历达尔文式的适应，允许它们进化以应对细胞外部和细胞内部的挑战。总之，这项工作为通过定向进化推进哺乳动物合成生物学和细胞工程应用建立了一个强大的平台。虽然哺乳动物合成生物学有望解决人类健康问题，但它需要克服主要障碍，包括优化合成设备的困难以及此类设备缺乏环境适应性。活的哺乳动物细胞内的定向进化有助于缓解这些挑战。然而，尽管基于活细胞的定向进化方法越来越多，但仍然非常需要一种适用于哺乳动物细胞的强大而通用的方法。一种理想的基于哺乳动物的定向进化方法应该将合成装置与宿主基因组隔离开来，以确保连续、正交和长期的进化，正如在大肠杆菌和酵母中所实现的那样。由于细胞增殖缓慢，它还需要克服在哺乳动物细胞内建立大型装置变体库的困难18。此外，一个相对广泛的突变谱对于遍历合成装置复杂的序列-功能景观是必要的，并将增强方法的通用性。此外，对多样化速率的可调节控制是非常需要的，因为这将允许调整诱变时间和步长以适应不同的应用。然而，现有方法不能满足上述所有标准。因此，开发新的基于哺乳动物的定向进化方法来克服现有的挑战是至关重要的。该研究选择在哺乳动物细胞内进化RNA，而不是像通常那样进化基于DNA的装置，原因有很多。首先，RNA干扰宿主基因组的风险最小(与DNA相反)，允许以正交方式进化。第二，哺乳动物细胞可以稳定地宿主许多拷贝的外源RNAs(与通常低拷贝数的外源DNA相反)，提供了一种创建可以进化的大型变体文库的方法。第三，可以使用来自RNA病毒的复制酶在哺乳动物细胞内复制RNA，其复制保真度可以通过抗病毒药物进行化学调节。哺乳动物细胞中具有增强的宿主相容性和稳定性的复制性RNA的工程化和表征
（图源自Nature Chemical Biology）
该研究开发了RNA复制酶辅助的连续进化(REPLACE ),这是一种用于哺乳动物细胞的基于复制RNA的定向进化技术，可确保与基因组的正交性，产生大的变异文库，允许对RNA诱变进行化学诱导控制，提供相对平衡和广泛的突变谱，并以连续(即，同时多样化和选择)或非连续模式运行。该研究展示了REPLACE的一系列应用，并设想它成为一个多功能和强大的合成生物学工具。总之，这些结果表明，哺乳动物细胞可以利用复制型RNA来适应细胞内在的挑战，从而细胞可以通过穿越多条突变路线来获得适应性优势，或者通过直接抵消S17N取代，或者通过安装其他功能获得突变，从而逃离显性阴性KRAS。
参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41589-024-01799-8#Sec38
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