导读：2024年5月，西奈山伊坎医学院Nicolas Vabret团队在Cell子刊STAR Protocols分享实验方法：Protocol for the development of mRNA lipid nanoparticle vaccines and analysis of immunization efficiency in mice。文章详细描述了mRNA疫苗的制备和体内外活性评估实验步骤，包含：mRNA序列设计、体外转录（IVT）模板DNA制备、IVT mRNA制备、mRNA-LNP包封、RNA质量检测和mRNA疫苗的免疫原性评估（体外细胞和体内小鼠试验）。
上期文章菌菌以示例形式介绍了mRNA疫苗的序列设计部分（Moderna mRNA-01273和辉瑞/BioNTech BNT12b2），感兴趣的小伙伴可查看早期文章或直接联系菌菌获取：133 8033 2910。
本期文章菌菌将继续分享：mRNA转录模板的制备流程，包括两种不同类型的DNA——线性化质粒DNA和PCR扩增的线性DNA。
01
质粒DNA模板的制备
合理设计的质粒序列通常经基因合成的方法制备。西奈山伊坎医学院Nicolas Vabret团队分享的Protocol以质粒DNA作为mRNA制备的起始原料，依次经质粒转化、菌种培养、质粒提取获得足够量的质粒DNA模板。
耀海生物提供各种预制型质粒模板（质粒+菌液）、以及IVT RNA产品（原液/冻干粉）、LNP成品，包括荧光蛋白eGFP、mCHERRY、荧光素酶Luciferase、重组酶Cre、抗原OVA等，高质量满足不同的实验或项目需求。如感兴趣可随时联系菌菌：133 8033 2910。
1.2 线性化质粒制备
这一步骤的目的是生成用于IVT反应的线性化DNA模板，避免质粒载体上额外序列的转录。具体操作包括：酶切反应、线性化质粒纯化和检测。
02
基于PCR的DNA模板制备
Nicolas Vabret的Protocol仅描述了质粒DNA模板的制备。然而除质粒DNA外，PCR产物也可作为IVT的模板。
RNA经典书籍《RNA Methods and Protocols》中描述了使用PCR制备DNA转录模板的方法。PCR产物的序列应包含启动子序列（上游）和目标mRNA编码序列（5’ UTR、CDS、3’ UTR、poly(A)尾巴），其中启动子序列的作用是结合RNA聚合酶，从而启动RNA转录本生成。
参考文献
