专题报道：郑万钧先生诞辰120周年纪念专题Ⅱ ||西北农林科技大学张鑫讲师团队开展铁杉属花粉形态及其聚类分析研究

关键词：铁杉属；花粉形态；扫描电镜；聚类分析

基金项目：国家植物标本资源库项目(E0117G1001)。

引文格式：陈芷涵, 尚鑫, 谢淦, 等. 铁杉属花粉形态及其聚类分析研究[J]. 南京林业大学学报(自然科学版), 2024, 48(4): 37-45.CHEN Z H, SHANG X, XIE Z, et al. Phylogenetic relationship and evolutionary patterns of Tsuga pollen morphology: a cluster analysis-based study[J]. Journal of Nanjing Forestry University(Natural Science Edition), 2024, 48(4): 37-4.DOI:10.12302/j.issn.1000-2006.202406025.

通讯作者

张鑫，男，中共党员，森林植物教研室主任，讲师，硕士研究生导师。中国林学会树木学分会常务理事。

第一作者

陈芷涵，女，毕业于西北农林科技大学，

本研究共收集到10种铁杉属植物及近缘种长苞铁杉花粉。由于时间、地域限制，除铁杉外，其余花粉通过蜡叶标本上的雌球花获得，具体采样信息见表1。

铁杉花粉取样于秦岭火地塘，于2022年4月于火地塘实验林场铁杉混交林中采集铁杉的小孢子叶球，待其自然散粉后收集，保存于-20 ℃冰箱用作后续实验。新鲜花粉均采集自胸径大于30 cm的无明显病虫害的健康植株。

将带有花粉的雌球花样本与花粉样本，用导电双面胶粘在金属台上，25 mA真空喷金80 s两次后，使用日立S-3400N扫描电子显微镜(SEM)进行观察、拍照记录花粉形态特征。

1.3.1 形态特征数据集的建立

每种随机选取10粒花粉粒，利用Image J软件测其极轴长度(P)、赤道轴长度(E)、气囊长(L)、气囊宽(W)、棘突长(L_s)、棘突宽(W_s)、棘突密度(N_s)。对于部分铁杉属花粉化石的形态数据，通过查阅相关记录文献获得。计算各项指标的平均值±标准偏差。花粉形态学描述术语参考王伏雄等、王开发和王宪曾、埃尔特曼。

1.3.2 性状的编码

采用等级数量编码方法进行编码，共选取11个性状(表2)，其中数值性状(numerical character，简称“N”)8个，数值性状不编码，直接以原始数据形式进行运算；导出性状(induced character,简称“I”)2个，以数值性状原始数据按公式计算得到；无序多态性状(disordered multistate character,简称“D”)1个，采用综合评分法编码，取连续排列的正整数1、2、3进行编码。

1.3.3 数据处理

使用Origin 2022软件，对原始数据进行标准化(STD)处理以消除不同量纲，以10个性状为变量，种类为观测值，以各种的所属组(H组、M组)作为分组依据进行主成分分析。R型聚类分析选用Ward法，以相关性系数为度量距离生成性状指标聚类的树状图，选择用于Q型聚类的指标；Q型聚类分析选用Ward法，以欧氏距离为度量标准制作树状图。

铁杉属花粉为N₁P₃C₁型，远极面具有一薄壁区(图1)，极轴长21.20~58.00 μm，赤道轴长42.74~95.30 μm，多无气囊，稀有气囊；花粉粒表面多疣状，稀微疣状；表面有棘突或无，棘突长0.83~1.67 μm，宽0.48~0.66 μm，长宽比值为1.38~2.75，有0.13~0.40个/μm²棘突(表3)。

长苞铁杉和山地铁杉花粉具气囊，其余各铁杉均无气囊(图1)。近缘种长苞铁杉与山地铁杉气囊大小差异明显，约为山地铁杉的3.66倍。加拿大铁杉赤道轴最短，极轴也最短，卡罗莱纳铁杉赤道轴最长，极轴最长。日本铁杉、卡罗莱纳铁杉、化石种1和化石种2极轴较长，在40 μm以上。长苞铁杉、异叶铁杉和化石种1赤道轴较长，在70 μm左右。

长苞铁杉花粉表面微疣状，较光滑；铁杉属花粉表面均具疣，山地铁杉表面较光滑，微疣状；加拿大铁杉、卡罗莱纳铁杉表面较粗糙，呈疣状；其余7种铁杉花粉外壁粗糙，表面有棘突，棘突长短、个数不尽相同。铁杉、米铁杉、云南铁杉、日本铁杉棘突较狭长，棘突长是棘突宽2倍以上；丽江铁杉、郁陵铁杉棘突稍短，棘突长接近棘突宽的2倍，其中异叶铁杉棘突最为短粗，棘突长宽比最小，仅为1.38。异叶铁杉花粉表面棘突个数最少，约0.13个/μm²；日本铁杉最多，为0.40个/μm²。此外,铁杉、云南铁杉和化石种3棘突也在0.30个/μm²以上，郁陵铁杉则在0.20个/μm²以下。

2.2.1 主成分分析

主成分分析贡献率结果(表4)显示，第1主成分的贡献率为67.259%，其中最显著的变量是纹饰赋值、棘突长宽比、棘突宽；第2主成分的贡献率为19.415%，其中最显著的变量是气囊体积、气囊宽、气囊长。前2个主要成分的总贡献率为86.674%，大于85%且两个主成分特征值均大于1，说明所选取的指标能较好解释样本的差异性，可以用于下一步分析。

主成分分析结果(图2)表明，M组与H组显著分离，M组主要集中在第1象限，与棘突有关指标距离较近；H组与长苞铁杉则在第3象限，与气囊指标关系较大。加拿大铁杉与卡罗莱纳铁杉与M组其他铁杉相距较远，处于第4象限(图2)。

化石种1与异叶铁杉、郁陵铁杉相似，化石种2则与卡罗莱纳铁杉、加拿大铁杉更加相似，化石种3与云南铁杉、日本铁杉和铁杉距离较近。此外，主成分分析结果将铁杉属按不同分布区分离开，东亚分布的各类群明显聚集在一起，北美分布各种较分散，但仍与东亚各种分离。

2.2.2 R型聚类分析

R型聚类结果(图3)表明，棘突长与棘突长宽比相关度较高，气囊长、气囊宽相关度较高，本试验将气囊长与棘突长宽比保留，用于Q型聚类分析。其他指标较分散，基本可以用于下一步Q型聚类分析。

2.2.3 Q型聚类分析

由Q型聚类分析结果(图4)显示，欧氏距离为12时，分为两大类：①无棘突，包括长苞铁杉、山地铁杉、卡罗莱纳铁杉、加拿大铁杉；②有棘突，包括铁杉、云南铁杉、日本铁杉、丽江铁杉、米铁杉、异叶铁杉和郁陵铁杉。化石种1与化石种3属于第①大类，化石种2属于第②大类。

欧氏距离为6时，分为3类：①有气囊、无棘突，包括山地铁杉、长苞铁杉；②无气囊、无棘突，包括卡罗莱纳铁杉、加拿大铁杉、化石种2；③无气囊、无棘突，仍包括铁杉、云南铁杉、日本铁杉、丽江铁杉、米铁杉、异叶铁杉和郁陵铁杉。

欧氏距离为2时，共分为6类：①长苞铁杉；②山地铁杉；③加拿大铁杉、化石种2；④卡罗莱纳铁杉；⑤铁杉、云南铁杉、日本铁杉、丽江铁杉、米铁杉；⑥异叶铁杉和郁陵铁杉。

综上，本研究认为根据棘突与气囊的有无，将铁杉属分为3类(欧氏距离为6)最为合适，可以较好地判断和区分铁杉属内各种花粉。

根据聚类分析结果(图4)，化石种1与郁陵铁杉、异叶铁杉相似，化石种2花粉与加拿大铁杉最为相似，化石种3在花粉形态上与日本铁杉、云南铁杉和铁杉组为姐妹群。

将Q型聚类分析结果与铁杉属分子系统发育树比较(图5)发现，两者具有一定的相似性。长苞铁杉、山地铁杉、加拿大铁杉与卡罗莱纳铁杉都位于基部位置，云南铁杉、日本铁杉、丽江铁杉与铁杉关系较近。但形态学聚类分析将长苞铁杉与山地铁杉支系、卡罗莱纳铁杉与加拿大铁杉支系视为姊妹群，而系统发育树则认为它们是嵌套结构。此外，形态学分析认为异叶铁杉与郁陵铁杉较为相似，分子系统树支持异叶铁杉与山地铁杉亲缘关系较近。

铁杉属植物花粉形态呈现出较为丰富的多样性。Q型聚类分析结果表明，气囊的有无与棘突特征是区分铁杉属花粉的重要依据。欧氏距离为6时，可据此将铁杉属花粉分为3类：①有气囊、无棘突类，为长苞铁杉与山地铁杉；②无气囊、无棘突类，为加拿大铁杉、卡罗莱纳铁杉和化石种2；③无气囊、有棘突类，为铁杉、云南铁杉、日本铁杉、丽江铁杉、米铁杉、异叶铁杉和郁陵铁杉和化石种1、3。邹惠渝等将铁杉属划分为3个组：铁杉组(Sect. 1 Tsuga)、北美铁杉组(Sect. 2 Canadensis)和大果铁杉组(Sect. 3 Hesperopeuce)，将卡罗莱纳铁杉、加拿大铁杉与异叶铁杉从铁杉组中分离为北美铁杉组Sect. 2 Canadensis，并将长苞铁杉独立成属。李楠则将长苞铁杉纳入铁杉属,分为长苞铁杉组(Sect. Heopeuce)、铁杉组(Sect. Tsuga)和大果铁杉组(Sect. Hesperopeuce)，本研究依据花粉形态所得的分类结果更为支持邹惠渝等的分组方案，但不同意其将长苞铁杉独立成属的观点。

花粉特征在一定程度上可以表现植物演化的一般规律。目前，一般认为花粉形态的演化顺序是气囊从有到无、体积由大到小、外壁纹饰由光滑到短棘突再到长棘突。分子与形态系统发育树中，有气囊的长苞铁杉和山地铁杉位于最基部，无棘突的加拿大铁杉和卡罗莱纳铁杉也位于发育树底端，而各类无气囊、有棘突的类群则位于发育树顶端。说明铁杉属中有气囊、无棘突为原始类型，无气囊、有棘突则为进化类型，铁杉属花粉的演化趋势为有气囊至无气囊、无棘突至有棘突。

铁杉属植物花粉形态的演化过程与其授粉方式密切相关。在有气囊花粉类群中，植株直立，依靠授粉滴捕获花粉，花粉无需被其他部位捕获。而在无气囊花粉类群中，花粉不能被授粉滴捕获，而是利用棘突附着于苞鳞背面，因此，棘突的数量和形态有利于花粉稳定附着于苞鳞背面。相较于有气囊花粉类群，棘突的出现无疑增加了铁杉属植物的受精成功率和生态适应性，极大保障了铁杉属植物的繁殖优势。

花粉形态的稳定性在一定程度上可以表现种属间的亲缘关系。根据聚类分析结果显示，山地铁杉与长苞铁杉互为姊妹群，卡罗莱纳铁杉则与加拿大铁杉互为姐妹群，异叶铁杉与郁陵铁杉亲缘关系最近，铁杉则与云南铁杉关系最紧密。Havill等与Feng等建立的分子发育树中，卡罗莱纳铁杉与加拿大铁杉嵌套进入了亚洲支系中，本研究则发现两者花粉形态与北美支系关系更紧密，与地理位置相对应。此外，本研究建立的铁杉属花粉形态发育树，其东亚分布的种类虽然聚类到了1个分支，但拓扑结构与分子系统发育树存在一定差异，这可能是东亚分布的铁杉属植物经历了多次杂交和演化，具有复杂的网状演化模式，为亲缘关系的界定带来较大的困难。

长苞铁杉是中国特有种，自发表以来，其分类地位具有颇多争议。郑万钧先生发现长苞铁杉苞鳞露出种鳞之外，不同于其他铁杉属植物，将其列为新种并和北美分布的山地铁杉纳入大果铁杉组中；Flous发现长苞铁杉叶上有散生斑点，薄壁细胞中有石细胞，与其他铁杉属植物明显不同，应独立成组。胡先骕先生首次提出建立长苞铁杉属(Nothotsuga)，得到了Page的支持。但又有学者通过染色体核型、木材结构方面的研究，认为应当将长苞铁杉纳入铁杉属长苞铁杉组。近来分子系统学证据表明，长苞铁杉区别于铁杉属，应独立为长苞铁杉属。本研究中发现，长苞铁杉花粉与山地铁杉花粉形态相近，只在花粉和气囊体积上略有差异，以花粉形态为分类标准，长苞铁杉并不能脱离铁杉属单独成属，支持将其纳入铁杉属的观点。

铁杉属花粉特征与其分布地有密切的关系。主成分分析与聚类分析结果中，北美分布的种类(异叶铁杉除外)与东亚分布的各种明显分离，说明同一地区分布的花粉存在一定的相似性。北美分布的铁杉属植物表面大多较光滑，而东亚分布种类表面均粗糙，附着有长短粗细不一的棘突。值得注意的是，北美分布的异叶铁杉具有棘突，与东亚分布郁陵铁杉亲缘关系最近，而与北美分布的其他种类亲缘关系较远。分子系统学研究支持异叶铁杉是同样分布于北美的山地铁杉的姊妹群，二者位于铁杉属的基部位置。花粉形态聚类只强调了不同种类花粉形态上的相似性，无法从遗传物质角度判断植物间的亲缘关系，仍具有一定的局限性。此外，分布于韩国郁陵岛的郁陵铁杉在2017年才被发现，其花粉形态与北美分布的异叶铁杉相似，可能与铁杉属的起源与扩散有关：始新世到中新世时期，白令陆桥是北美洲与亚洲进行物种交流的重要走廊，两个地区的植物可能通过此通道进行了交流。

在铁杉属花粉形态研究基础上，笔者尝试了对化石花粉的鉴定。化石种1花粉无气囊、外壁有棘突，聚类分析中其处于异叶铁杉和郁陵铁杉支系的基部，因为花粉来源于奥地利中新世地层，推测其可能为异叶铁杉和郁陵铁杉祖先类型曾经在欧洲分布的遗迹。化石种2形态上与加拿大铁杉、卡罗莱纳铁杉相近，均无气囊、外壁纹饰疣状，根据聚类分析结果，鉴定化石种2为加拿大铁杉花粉。聚类分析结果将化石种3嵌套在包含铁杉、云南铁杉和日本铁杉支系的基部位置，推测该化石与该分支其他种的祖先具有密切关系。

综上所述，根据花粉形态特征对铁杉属进行分类和亲缘关系探究具有一定的科学性与准确性；尤其是依据花粉气囊的有无与外壁纹饰特征，可以较好地对大多数铁杉属花粉进行分类，对铁杉属花粉的鉴定与亲缘关系的探究也具有积极意义。