论文推荐 || 广西亚热带作物研究所高级农艺师毛立彦团队开展基于SSR分子标记的睡莲遗传多样性分析

1.2.1 DNA提取

采用CTAB法提取睡莲基因组DNA，并往提取体系中加入磁珠，沉降DNA的乙醇体积分数为80%，配以磁力架进行改良。采用琼脂糖电泳和NanoDrop 2000检测 DNA 的质量和浓度，并统一稀释DNA质量浓度至50 ng/μL，-20 °C保存备用。

 1.2.2 引物设计及引物筛选

根据福建农林大学已发表的睡莲基因组[6]数据，采用微卫星识别（MISA）软件（http：//pgrc. ipk-gatersleben. de/misa/）搜索睡莲14条染色体序列基因组的SSR位点，设置SSR检索标准：检索重复单元为 2、3、4、5、6 bp，重复长度≥12 bp；二核苷酸最小重复次数≥6 次(总长度不少于 12 个碱基)，三至六核苷酸最小重复次数≥5 次(总长度不少于 15、20、25 和 30 bp)。采用 Primer 3.0 引物批量设计程序对二至六核苷酸重复类型以及复合的 SSR 位点两端序列设计特异性引物，目的产物大小为100~350 bp，经华大基因合成后，分别从5个亚属的种/品种中各选1个样品[分别为：蓝星睡莲（N. colorata）、'白巨'睡莲（N. gigantea'Albert de Lestang'）、鲁吉娜睡莲（N. rudgeana）、印度红睡莲（N. rubra）、白睡莲（N. alba）]进行PCR扩增。PCR反应体系（20.0 μL）为ddH2O 14.8 μL，dNTP 0.4 μL，缓冲液 2 μL。正反向引物各0.3 μL（2×10-5mol/L），DNA模板2 μL，Taq 酶0.2 μL。反应程序为94 °C预变性5 min；94 °C变性30 s，60~50 °C（每个循环降低1 °C，10个循环后50 °C 25个循环）复性35 s，72 °C延伸40 s，共 35个循环；最终72 °C延伸3 min。扩增产物采用质量分数1.5%琼脂糖电泳进行初步检测，从中选取扩增质量好的SSR引物扩增产物进行进一步的质量分数6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

1.2.3 荧光引物PCR扩增及毛细管电泳检测

将筛选得到的扩增质量好、多态性高的引物在华大基因有限公司进行荧光引物（FAM、HEX）合成后，进行147份睡莲样品的PCR扩增，扩增体系与反应程序和引物筛选实验一致。扩增产物采用ABI 3730X测序仪（赛默飞世尔，美国）进行毛细管电泳检测。

采用GeneMarker 2.2.0进行原始数据分析，得到初步处理的SSR分子标记数据后，以1个引物为1个等位基因位点，将每个样品在各个等位基因位点的片段大小统计成0/1矩阵，根据0/1矩阵采用Popgene 1.32进行遗传多样性指标计算[平均等位基因数（N_一个），有效等位基因数（N_e），Nei's基因多样性指数（H），Shannon's信息指数（I），多态性指数PIC]。采用NTSYS 2.0软件计算遗传相似系数，采用UPGMA法进行聚类分析，采用Mxcomp程序进行遗传相似系数的主坐标分析（PCoA），构建2、3维空间的散点分布图以检验聚类结果。

2.1.1 SSR引物筛选结果

 本研究共选取均匀分布于14条染色体的150对SSR引物， 对5个种/品种睡莲进行PCR扩增，采用15 g/L的琼脂糖凝胶进行初步筛选，从中筛选出19对扩增质量好的引物（编号依次为P9、P10、P15、P23、P27、P45、P51、P54、P55、P58、P60、P67、P68、P73、P112、P122、P124、P129、P134），采用筛选出的19对引物的扩增产物进一步进行60 g/L的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（图1），从中筛选出了11对主带明显、杂带少、背景清晰、扩增条带多、多态性好、条带差异明显的引物，分别位于2、4、5、7、8、9、11、12号染色体上，11对引物的扩增产物大小为194~279 bp（表2）。对筛选出的11对引物进行荧光标记后进行后续147份样品的扩增，标记类型如表2所示。

2.1.2 扩增多态性分析

利用11对引物的毛细管电泳结果峰图(其中引物P15对8份随机睡莲样品的毛细管电泳结果峰图见图2)，构建147份样品的0/1矩阵，根据0/1矩阵计算遗传多样性指数(表3)可知，11对引物在147个样品中共扩增出307个多态性等位基因位点。软件分析可知，N_一个变幅为4~7，平均值为5.36，引物P124位点最多为7个，P15和P45位点最少为4个；N_e变幅为1.042 8~1.117 5，平均值为1.071 8；H变幅为0.038 0~0.086 2，平均值为0.056 2；I变幅为0.085 6~0.163 8，平均值为0.114 4；PIC变幅为0.46~0.60，平均值为0.53，其中7 个位点（P15、P27、P45、P67、P112、P124、P129）具有高多态性（PIC>0.50），其余4个位点（P51、P58、P73、P122）具有中等多态性PIC为（0.25，0.50]。11对引物中P112的多态性最好，其N_e、H、I、PIC均为11对引物中最高，分别为1.117 5、0.086 2、0.163 8、0.60（表3）。

2.2.1 147份睡莲样品的聚类结果分析

 依据11对SSR引物的多态性构建0/1矩阵计算147份样品的遗传相似系数，据此进行UPGMA法聚类，聚类结果如图3所示。经计算，147份样品的遗传相似系数值范围为0.781 8~0.993 5，平均为0.899 2；其中‘赤子心’(7)和‘锦黄’(82)之间、杂交后代10和11之间的遗传相似系数最大，为0.993 5，亲缘关系最近；‘白巨’(97)和‘科曼契’(110)之间的遗传相似系数最小，为0.781 8，亲缘关系最远。

 在遗传相似系数为0.879 0时将147份睡莲样品聚为6个分支，其中越南延药（143）（II.）和'科罗拉多'（70）（III.）分别单独聚为1支。Anecphya亚属的6个种、2个品种和Anecphya亚属×Brachyceras亚属的2个品种遗传相似系数为0.820 8~0.964 2，Anecphya亚属×Brachyceras亚属2个品种遗传相似系数为0.915 3，与Anecphya亚属之间的遗传相似系数为0.820 8~0.902 3，被聚为第IV.[（粉巨（95）、'卡奔'（96）、'白巨'（97）]、V.分支（3个原种：紫IM（100）、白IM（103）和变色澳洲（141），2个品种红IM（99）和'流苏'（104），Anecphya亚属×Brachyceras亚属2个品种：'凯斯隆'（101）和'Tuonta'（102）。Brachyceras亚属的17个原种、53个品种、28个杂交后代（遗传相似系数为0.846 9~0.993 5），全部的Lotos亚属（遗传相似系数为0.912 1~0.990 2）、 Hydrocallis亚属（遗传相似系数为0.899 0~0.941 4）和Nymphaea亚属3个原种、9个品种、Nymphaea亚属×Brachyceras亚属3个品种（遗传相似系数为0.931 6~0.954 4，与Nymphaea亚属的遗传相似系数为0.840 4~0.941 4）、Brachyceras亚属×Anecphya亚属的1个杂交后代（与Brachyceras亚属的遗传相似系数为0.876 2~0.947 9）聚为第I.分支。Nymphaea亚属1个原种[白睡莲（119）]、4个品种聚为第VI.分支。其中Nymphaea亚属4个原种、14个品种遗传相似系数为0.820 8~0.960 9。

 在遗传相似系数0.885 0时将第I.分支进一步分为两大类：第i.大类由除越南延药（143）外的Brachyceras亚属、Lotos亚属、Hydrocallis亚属及Brachyceras亚属×Anecphya亚属的1个杂交后代组成，第ii.大类由除III.、VI.分支的Nymphaea亚属和Nymphaea亚属×Brachyceras亚属的品种组成。第i.大类在遗传相似系数0.914 0时分为5个小类，其中'仲克尼'（80）（C）、增殖睡莲（87）（D）及美洲白睡莲（147）（B）分别单独聚为1个小类；Hydrocallis亚属的3个原种和Brachyceras亚属的15个原种、53个品种、28个杂交后代和Brachyceras亚属×Anecphya亚属的1个杂交后聚为第A小类（在遗传相似系数为0.914 5时，Hydrocallis亚属的3个原种聚为1个小分支；Brachyceras亚属的15个原种、53个品种、28个杂交后代，Brachyceras亚属×Anecphya亚属的1个杂交后代聚为另一个小分支），全部的Lotos亚属聚为第E小类。第ii.大类在遗传相似系数0.91时分为3个小类，其中第a小类由Nymphaea亚属的原种墨西哥黄（114）及品种'万维莎'（105）、'黄西瓜'（109）、'黄乔伊'（120）组成，第b小类由Nymphaea亚属6个品种和Nymphaea亚属×Brachyceras亚属的3个品种组成（在遗传相似系数为0.93时由Nymphaea亚属6个品种聚为b1小支，Nymphaea亚属×Brachyceras亚属的3个杂交种聚为b2小支)，第c小类由原种小白子午莲(116)和雪白睡莲(117)组成。

 2.2.2 35份原种和35份杂交后代的聚类分析

 11对引物中未发现能将35个原种完全分开的引物，将11对引物进行两两组合对35个原种进行聚类分析，结果(图4)可知，共获得5个能够将35个原种完全分开的引物组合。根据5个引物组合及11对引物分别在35个原种中产生的多态性位点计算得到遗传相似系数分别是引物P15+P112为0.785 7~1.000 0，P27+P112为0.779 7~1.000 0，P45+P112为0.7091~1.000 0，P45+P124为0.708 3~1.000 0，P67+P112为0.728 8~1.000 0；11对引物为0.751 0~0.979 3。分别在遗传相似系数0.882 0、0.877 5、0.886 0、0.854 5、0.864 0、0.852 5时将其聚为5个分支。5个引物组合和11对引物聚类一致的样品有：33(红叶美洲白睡莲)、34(卵叶睡莲)、35(蓝星睡莲)、46(海南延药)、50(非洲延药)、51(‘蓝蟹爪’)、68(‘粉色好望角’)、74(蓝色好望角)、81(小花)、87(增殖睡莲)、114(墨西哥黄)，96(卡奔)、97(‘白巨’)，100(紫IM)、103(白IM)，125(鲁吉娜)、128(印度红)、129(‘泰国粉’)、130(喀麦隆)，139(小雪夜)、140(秘鲁睡莲)，144(印度延药)、145(优雅睡莲)、146(埃及蓝)，不同引物对组合的数据聚类方式的聚类结果与形态学分类存在差异，如114(墨西哥黄)、116(小白子午莲)、117(雪白睡莲)、119(白睡莲)在形态学上均属于Nymphaea亚属，87（增殖睡莲）、125（鲁吉娜）、139（小雪夜）、140（秘鲁睡莲）在形态学上均属于Hydrocallis亚属，在本研究中并未能将其很好地聚在一起。

 11对引物中不论是单独或者两两组合均不能将35份杂交后代分开（图5），35个杂交后代中的遗传相似系数为0.544 3~0.962 0，分别于0.741 5和0.767 5时将35个杂交后代聚为2类（Brachyceras亚属的28个杂交后代和Brachyceras亚属×Anecphya亚属的1个杂交后代聚为1类，Lotos亚属的6个杂交后代聚为1类）和3类（Brachyceras亚属的28个杂交后代聚为1小支，Brachyceras亚属×Anecphya亚属的1个杂交后代单独聚为1小支，Lotos亚属的6个杂交后代聚为1小支），其聚类结果与实际的杂交结果一致。

为更好地反映147份睡莲样品的亲缘关系，基于遗传相似矩阵进行了主坐标分析，形成147份睡莲样品的位置分布图(图6)，位置相近表示亲缘关系密切，位置距离远表示亲缘关系远。经计算，1~3主坐标分别占比总遗传变异的16.54%、8.35%、5.43%，共占比总遗传变异的30.32%。由图6可知，Brachyceras亚属的多数园艺品种和原种均向轴1的右侧发散，只有少数原种略向左发散（如美洲白睡莲、优雅睡莲等），而Brachyceras亚属是睡莲属中独具芳香和三体雄蕊的睡莲类型，因此推测轴1可能与睡莲种质的香气形成和雄蕊发育变异有关；夜开型的Lotos亚属和Hydrocallis亚属向轴2的下方发散，其他类型睡莲在轴2均向上发散，且Nymphaea亚属睡莲发散得最远，因此轴2可能与睡莲种质的开花时间和环境适应性相关；轴3向下方发散的种质均为Anecphya亚属，其花型与荷花类似，其他亚属均向上发散，因此推测轴3主导着睡莲花型变异。

 借助主坐标分析三维图(图6a)可知，147份睡莲样品的主坐标分析结果与传统形态学分类相似。Anecphya、Nymphaea和Lotos亚属种质均各自偏向于同一方向的空间维度上。绝大多数的Brachyceras亚属亦偏向于同一方向的空间维度上，仅有越南延药（143）等少数Brachyceras亚属种质零散分布。Intersubgeneric亚属是跨亚属品种质，其中'诗丽吉皇后'（122）、'暹罗粉'1（123）和'暹罗紫'1（124）偏向于其Nymphaea亚属杂交母本所处的空间维度，'凯斯隆'（101）和N.'Tuonta'（102） 偏向于于其Anecphya亚属杂交母本所处的空间维度，这与分子聚类结果相同。进一步结合分子聚类结果可知，第Ⅱ分支的延药睡莲处偏向于三维空间中间平面，与第Ⅰ分支中的第Ⅰ分类的白蓝星(142)和优雅睡莲(145)更加接近，第Ⅲ分支的‘科罗拉多’也处于三维空间近中间的平面，但更加偏向于与第1分支Ⅱ分支的墨西哥黄(114)和小白子午莲(116)，这表明在亲缘关系上延药睡莲与第Ⅰ分支的第Ⅰ分类种质更近，‘科罗拉多’与第Ⅰ分支的Ⅱ分类种质的亲缘关系更近。

 在平面图中，分子聚类结果中的第I分支包含的Lotos亚属种质位于平面的左下角，Anecphya亚属及两个Anecphya亚属为母本的跨亚属杂交种质，位于近水平中线偏左下的位置。Nymphaea亚属及3个Nymphaea亚属为母本的跨亚属都偏向于左上角。大部分的Brachyceras亚属均位于水平线及两侧偏右位置，Hydrocallis亚属种质与Anecphya亚属种质在二维图的偏向性相似。

遗传多样性研究对种质资源的保护、遗传改良、杂交育种以及创新利用具有重要意义，SSR标记具备扩增谱带少、多态性高、操作简单、易于识别和统计、可快速鉴定品种等优点，广泛应用于多种作物的遗传多样性分析。其中，SSR荧光标记比普通SSR标记方法的鉴定效率更高、结果更准确，已被应用于睡莲属种质资源的遗传多样性研究，如苏群等利用16对引物在240个睡莲品种中检测到205个等位基因；Parveen等利用57对SSR引物在92个N. nouchali个体中检测到277个等位基因。本研究采用荧光标记多态性引物对147份睡莲样品的遗传多样性进行分析，筛选到11对SSR引物，共扩增出307个多态性等位基因位点，这11对引物分布于睡莲全基因组的8条染色体上，大多为2碱基重复引物。研究表明，物种的SSR位点多态性区别在其重复单元的重复次数不同，2碱基重复频率最高，更容易获得较高的SSR多态性，表明本研究所筛选的SSR引物可较多获得睡莲属植物的遗传多态性信息。

 本研究选用的睡莲种质样品以人工选育的园艺品种(77份)和杂交后代(35份)为主，原种仅为35份。前人研究表明，高强度的人工选择会降低群体遗传多样性，这可能是造成本研究结果中PIC、N_e、H和I值低于苏群等和Parveen等开展的睡莲种质SSR标记分析结果的重要原因。但试验所选样品来源于不同地域，材料来源较为复杂，加之绝大多数的睡莲为异花授粉，群体拥有较高的杂合度，故本研究筛选的11对引物亦能获得丰富的多态性，可用于鉴定睡莲种质的亲缘关系。

当前睡莲种质资源的亚属及种间的分类尚未明确，杂交育种工作常面临着依据传统分类学筛选的亲本之间亲缘关系不清晰、杂交不结实或败育率高等问题，SSR标记聚类结果有助于了解睡莲种质之间的亲缘关系，可为睡莲育种亲本的选择提供科学参考。研究表明，物种种质间的遗传相似系数值越大，说明亲缘关系越近；反之，亲缘关系越远，杂交成功率越低，但获得杂种优势的可能性越大。本研究通过分析147份睡莲种质亲缘关系发现，第I.分支分类与传统的形态学分类结果相似，第i.大类由Brachyceras、Lotos和Hydrocallis亚属组成，第ii.类由部分Nymphaea亚属组成，其中Brachyceras、Lotos和Hydrocallis亚属按生态学分类归属于热带睡莲，表明特定生境可能导致这3个亚属物种拥有相似的分子水平进化趋势。第Ⅰ分支第ⅰ大类中作为睡莲属仅有的具备花胎生生殖特性的原种增殖睡莲(87)，和唯一具备高重瓣特性的原种仲克尼(80)各单独划分为1个小类，表明这2个原种与其他热带睡莲在遗传特性上存在较大差异，亲缘关系较远，推测这一现象可能与这2个原种的独特遗传性状有关。第ii.大类中a小类的样品花瓣均有黄色，而b小类的样品花瓣颜色多为粉、红、紫， c小类的两个原生花瓣均为白色。张旻桓等的研究显示，花色相近或相同的牡丹（Paeonia suffruticosa）品种遗传距离较近，亲缘关系与花色存在一定相关性，推测睡莲种质的种间亲缘关系远近亦与花色基因的进化存在关联。

5份跨亚属品种和1个跨亚属杂交后代的聚类结果均与母本材料聚在一起，这与其表型高度一致，表明在睡莲的杂交育种中，杂交后代更偏向于母本的表型，因此在实际杂交育种工作中需根据杂交目的选择合适的母本以便快速达到杂交目的。

已报道的基于睡莲种质表观形态或同工酶种类聚类的遗传多样性研究均显示，供试Nymphaea亚属种质均聚类为一个分支。本研究供试的Nymphaea亚属种质中，'科罗拉多'单独聚为第III.分支，白睡莲（原种）和4个园艺品种'马哈巴颂''科曼契''佛琴娜丽丝''霍兰迪亚'聚类为第VI.分支，其余的Nymphaea亚属种质则划归第I.分支类群。这一结果与苏群等对240份睡莲种质的SSR标记结果一致，推测可能是Nymphaea亚属内部具有丰富的遗传变异，仅以形态学进行分类具有一定局限性，而筛选的SSR引物丰富度不够、覆盖面不广也是影响试验结果的重要因素。本研究供试的Lotos亚属种质遗传相似系数均在0.9以上，在第I.分支的第I.类中更接近于进化树的基部，表明该亚属进化地位比Brachyceras亚属种质原始，这一结果符合黄国振等关于睡莲属的形态分类学观点。

主坐标分析（PCoA）与UPGMA均能对种质样品进行聚类分析，前者从不同方向、不同层面更加直观地显示各种质间的关系，而后者对密切关注的种质个体具有较高的分辨率，两种聚类分析方法结合使用，可以更加全面地解释聚类结果。赵亚军等的研究显示，油菜（Brassica napus）的23个自育品种（A群）和39个其他主栽品种（B群）聚类为3类分支，自育品种'青油14'在分子聚类上位于第III.类，但无法区分它与聚类结果的第I.、II.类种质的亲缘关系远近，借助主坐标分析发现'青油14'位于二维图自育品种（A群）内、三维图的A群右角，最终确定它与A群遗传关系较近，与其他主栽品种（B群）远。本研究中依据传统的形态学分类越南延药属于Brachyceras亚属，'科罗拉多'划归Nymphaea亚属，但分子聚类将越南延药单独划为第II.分支，'科罗拉多'则单独形成第III.分支，基于聚类结果无法有效地分辨两者种质与其他分支类群的亲缘关系远近，而主坐标分析恰好弥补这一缺陷，更加全面地反映了睡莲种质之间的亲缘关系。

本研究筛选得到了11对多态性丰富的引物，可用于鉴定睡莲种质的亲缘关系。通过对147份睡莲属种质遗传多样性的分析，进一步验证了SSR标记的高效性及准确性。147份睡莲种质可划分为6个一级分支，与传统形态学分类结果相似，但在二级和三级分支上如Nymphaea亚属种质的分类与传统形态学分类观点存在一定差异，且少部分品种如越南延药、'科罗拉多'依据形态学分类无法有效地鉴定其与其他种质的亲缘关系。笔者结合主坐标分析进一步明确了越南延药和‘科罗拉多’与二级分支上的种质亲缘关系远近。依据亲缘关系越远，获得杂种优势的可能性越大的理论，两者均是潜在的优良育种亲本材料。进一步研究中应结合形态表型数据，加大引物和样品的筛选量，进行多种分子标记联合分析，以筛选出能更精准、快速鉴定睡莲属种质的引物和标记类型。