论文推荐||上海市园林科学规划研究院张冬梅正高级工程师团队开展白玉兰二次开花诱导与生理调控研究

1.2.1 开花统计

统计二次开花的白玉兰植株数，记录二次开花时间。计算开花株率(%，开花株占处理株数之百分比)；观察并统计二次开花的花朵数，计算平均单株开花量(合计单株开花量与处理株数之比)，取平均值。对两年数据采用DPS统计软件分别进行方差分析及LSD多重比较。

 1.2.2 花芽发育形态观测

自2020年4月下旬始至6月上旬止，每周选取10个位于树冠中上部枝条顶端的花芽测量芽长及芽宽。同时每2周采集3个芽，剥去外部包裹的芽鳞片，取中心芽用体积分数25%戊二醛溶液固定。在第3阶段激素处理前，X1、X2、X3均为海藻糖喷施处理，前期处理方法相同，为减少重复采样，采用混合取芽方式、合并记为B1处理；同理，X4、X5、X6合并记为B2处理，分别对B1、B2、X0(对照)取芽进行花芽发育石蜡切片观察。

 1.2.3 内源激素含量测定

于2021年白玉兰花芽分化不同时期:花芽分化起始期、完成期，花芽膨大裂苞期(开花前期)对Y1、Y2、Y4处理进行取样。其中花芽分化起始期(5月10日)取的芽处于营养生长期结束、启动花芽分化的成花转变时期，样品标号后缀记为“-V”(vegetative period)，花芽分化完成期(6月4日)属生殖生长阶段，样品标号后缀记为“-R”(reproductive period)，花芽膨大裂苞期是即将裂苞启动开花的时期，样品标号后缀记为“-F”(flowering period)， 采取对照Y0处理未开花花芽，样品标号记为“Y0-N”作为未开花对照(取样时间7月2日)。取至少2 g的芽材料混合后作为1个样品待测，每处理3个重复，放入10 mL贴好标签的离心管中，并立即投入干冰中速冻，短期运输后置于-70 ℃冰箱保存待测。测前迅速液氮固定，提取测定激素。

 1.2.4 数据分析

采用高通量靶标代谢组学检测24种植物内源激素，测试完成后对内源激素的定量值计算欧氏距离矩阵(Euclidean distance matrix)，以完全连锁方法对内源激素代谢物聚类，并以热力图进行分析，绘制层次分析聚类热力图。

白玉兰自花谢后即进入营养生长期，3月下旬—4月枝条快速生长，5月上旬开始，伴随枝条营养生长减缓，白玉兰进入生殖生长期、启动花芽分化。花芽分化前的白玉兰短枝顶芽细长瘦弱，自 5月上旬开始顶芽明显膨大变粗，尤其是5月下旬至6月初，白玉兰花芽进入快速膨大期，芽长、芽宽增长近1倍。石蜡切片显微观察发现，白玉兰花芽分化经历花芽分化起始期(5月上旬)、花瓣原基分化期(5月中旬)、雄蕊原基与雌蕊原基分化期(5月下旬)，至6月上旬花芽分化趋于完成进入花芽分化完成期。观察发现,营养施肥处理株花芽较未处理对照有一定数量增多，但各处理花芽分化时期早晚差异不明显(图1)。

通过施肥与激素处理等综合措施运用可使早春已开花白玉兰植株年内二次开花(表2)，所有二次开花的处理均在激素施用处理中实现，其中细胞分裂素处理(X1)与赤霉素处理(X5、Y2)达到100%的处理株开花。不同激素诱导效果不同,细胞分裂素与赤霉素可促使白玉兰花芽膨大、启动开花,而脱落酸处理(X3、X6)未能诱导实现白玉兰二次开花。从开花株率与平均单株开花量看，细胞分裂素处理与赤霉素处理间差异未达显著水平(P>0.05)。前期未施用营养肥,仅在后期花芽分化完成后树冠喷施细胞分裂素(6-BA)或赤霉素(GA₃)，即可实现花芽膨大开花 (X7、Y3、Y4处理)，可见激素可独立诱导白玉兰成熟花芽进入开花程序，营养肥施用不是开花的必要条件。

不同于早春先花后叶，夏季二次开花的白玉兰是花叶同在(图2e—2f)。X1处理开花时间最早,为7月14日(图2d)，此时正值上海夏季高温季节，日最高温度在30 ℃以上，单朵花从花瓣伸展绽放到凋落枯萎、持续2~3 d，较春季开花持续期缩短2~3 d。后期以激素注射方式代替喷施，单株开花量从2020年的2~6朵/株增加至2021年16(Y1，图2e)与22朵/株(Y2，图2f)，植株整体开花效果明显提升。

从开花早晚看，细胞分裂素处理组(X1、X4)诱导二次开花时间略早于赤霉素处理组(X2、X5)，海藻糖营养施用处理组(X1、X2)略早于蔗糖处理组(X4、X5)。由激素使用开始至第1朵花开放需(30±10)d，随气温高低及注射方式不同而有变化。针管注射激素吸收效率高，诱导二次开花时间间隔短(Y4)。将起始激素处理时间推迟到7月14日(X7)，则至开花仅需20 d左右,通过延后处理的方式能够顺延白玉兰二次开花时间，由此，可精准实现7—8月白玉兰二次开花目标。

细胞分裂素与赤霉素除了诱导白玉兰花芽膨大而开花外，植株生长表现也会发生一些变化。经细胞分裂素处理的白玉兰植株，部分叶枯焦落叶,伴有枝条隐芽、不定芽大量诱导萌生，后续会抽枝发叶(图2g)；而赤霉素处理株枝条夏季休眠被打破而发枝伸长(图2h)，这在正常白玉兰生长中较为少见。

2.3.1 不同发育时期花芽内源激素含量变化

由营养生长转入生殖生长、开始花芽分化直至花芽膨大裂苞、开花的不同发育阶段，芽内源激素代谢发生着变化(图3a、3b)。由营养生长转入花芽分化成熟，白玉兰花芽内源激素变化表现为:幼嫩组织激素如细胞分裂素类，IPA(异戊烯基腺苷)、IP(异戊烯基腺嘌呤)、tZR(反式玉米素核苷)降低，而与组织成熟有关的激素 ABA(脱落酸)、GA₃(赤霉素)含量增加，同时与花器官发育相关的激素JA(茉莉酸)与JA-Ile(N-茉莉酸-异亮氨酸)也有所增加。白玉兰花芽分化完成后即进入休眠，而使用外源激素(赤霉素或细胞分裂素)可促使花芽打破休眠而启动开花，内源激素调控变化主要为生长素类激素IAA(吲哚-3-乙酸)或ME-IAA(吲哚-3-乙酸甲酯)增加，而与成熟及衰老相关的激素SA(水杨酸)、H2-JA(二氢茉莉酸)、ABA(脱落酸)则有所下降。发育成熟的花芽内源ABA含量较高，但经外源细胞分裂素(6-BA)与赤霉素(GA₃)处理后，花芽内脱落酸(ABA)含量下降，内源生长素类激素(IAA、ME-IAA)则维持在较高水平，这些激素变化必然与打破花芽休眠促使花苞开裂而开花存在一定联系。

2.3.2 不同处理方法花芽内源激素含量变化

花芽分化完成后，外源激素(6-BA、GA₃)处理阻断白玉兰已发育成熟花芽休眠而直接启动开花程序进而开花。较未开花对照(Y0-N)，外源细胞分裂素(6-BA)处理植株花芽ME-IAA、IPA、JA-Ile、JA含量较高，而外源赤霉素类(GA₃)处理植株花芽内源tZR、GA₁、GA₃含量较高(图3c)。

自然条件下，白玉兰花芽分化完成后，即进入长达8个月的休眠期，至第2年早春随着气温回升，花芽开始膨大、启动开花。白玉兰花芽发育完全后，施用外源细胞分裂素或赤霉素，可诱导白玉兰成熟花芽即时启动开花程序，且不依赖于前期营养积累。激素适合的施用应在6月中、下旬白玉兰花芽分化完成以后进行，树干注射激素较叶面喷施对白玉兰二次开花效果更直接，这可能与喷施损耗大且易造成叶表面糖累积堵塞气孔而影响叶片吸收有关。

 开花是一个能量消耗的过程，需要一定的营养储备。对‘常春’二乔玉兰研究中发现，春、夏两次成花过程中枝条可溶性糖含量均有不同程度的降低，可溶性糖利于开花的实现。糖在植物体内特别是花芽中的含量与开花显著相关。糖作为一种信号因子调控植物内源激素水平从而调控开花，外施蔗糖或者海藻糖可加快‘红元宝’紫玉兰二次花芽分化的进程，尤其是第2次分化花芽中的海藻糖和蔗糖含量有显著提高，海藻糖可能参与了内源激素的运输，通过调控激素的合成与分解途径而影响内源激素水平，而在花芽分化与开花中扮演着重要角色。从本研究结果来看，外施营养元素可增进树体营养积累，促进枝条营养生长，一定程度促进白玉兰花芽分化，但不是开花诱导的必然条件。

 后续观察发现，2020年夏季二次开花的白玉兰植株，次年(2021年)春季植株上留存的少量花芽会正常开花，花后继续花芽分化至第3年(2022年)春季开花，但第3年夏秋季赤霉素处理株(X2、X5)在无任何人为干预的情况下个别株“再次”二次开花。激素作用促使白玉兰二次开花，打破了植株正常的开花节律，并且在植株体内产生了“记忆”，亦可能是2022年夏季持续40 ℃极端高温带来的叠加效应，其内在原因值得进一步研究。据对2020、2021两年实验处理期间的气象因子对比，气温差别并不显著，二次开花的时间主要与激素处理时间有关，且激素的有效吸收直接关系到二次开花效果。

3.2.1 不同发育时期内源激素调控

比较不同发育时期花芽内源激素含量变化，自花芽分化起始至花芽分化完成期间， 伴随花芽分化成熟，内源GA₃含量明显增加，ABA有不同程度的增加， tZR、IP与IPA等细胞分裂素类激素均有所下降，其中tZR降低明显；后期自花芽分化完成期至花芽膨大裂苞期间，虽施用的是不同的外源激素，但花芽成熟裂苞、转而开花的内源激素变化存在共同点，即IAA、ME-IAA升高，而ABA降低，外源激素的施用影响到花芽内部激素的平衡。由此分析，在花芽分化起始到成熟过程中，GA₃、ABA升高有助于花芽分化成熟，而打破花芽休眠、进入开花程序则需要较高水平的IAA以及低水平的ABA，这与肖爱华等在红花玉兰(Magnolia wufengensis)以及牛辉陵等在枣(Ziziphus jujuba)中的研究结果一致，GA₃、ABA、IAA等植物内源激素参与了白玉兰花芽分化与开花调控。

 3.2.2 不同处理方法内源激素调控

白玉兰植株在花芽分化完成至启动开花过程中，外源施用细胞分裂素诱导内源JA与JA-Ile增加，茉莉酸在植物衰老过程中发挥着重要作用，尤其是在促进植物叶片衰老方面，这也解释了6-BA处理植株出现部分叶枯焦并伴随落叶的现象，可能是白玉兰植株启动胁迫诱导反应的结果。除此以外，细胞分裂素处理诱导IPA增加，IPA为一种结合态细胞分裂素结合在tRNA上，构成tRNA的组成成分，可诱导植物细胞的分裂与增殖，在诱导芽的分化、叶绿体发育、养分运输及植物抗衰老等方面发挥着作用，白玉兰大量不定芽诱导增生可能与此有关。

 外源赤霉素处理与细胞分裂素处理株内源激素调控差异较大，外施GA₃导致内源赤霉素类物质GA₁、GA₃显著增加，从而诱导白玉兰植株开花，这与孙斌、温璐华等研究发现高水平GA₃ 可促进金银花(Lonicera japanica)、果梅(Prunus mume)等植物开花、使花期提前的结果一致。分子研究揭示:赤霉素可通过GAF1-TPR复合体抑制开花抑制因子而促进植物提早开花，赤霉素具有促使植物细胞伸长、茎伸长的作用，这也解释了为何外源赤霉素处理使得夏季本已停止生长的白玉兰植株枝条再次发枝伸长。Kinet认为，低浓度IAA 含量为花芽孕育所必需，而打破花芽休眠开花则需要高浓度生长素IAA或GA3等赤霉素类内源激素的积累，在白玉兰开花的诱导调控中得到证实，并且内源激素间的平衡在植物开花调控中扮演着重要角色。

 3.2.3 开花诱导调控通路

植物开花调控是一个复杂的过程，受多种外界环境因子如营养条件、光照、温度、水分状况等影响， 而开花诱导存在多种调控通路，包括光周期(光依赖)、春化、自主、赤霉素、温度及年龄通路等，各通路间既彼此独立又互相交联，构成一个复杂的网络，实现对植物开花时间的精细调节。白玉兰花芽对气温变化非常敏感，春季开花诱导主要受温度通路调控。赤霉素诱导白玉兰二次开花，证明白玉兰中存在赤霉素通路。细胞分裂素诱导白玉兰开花的同时出现枯叶、落叶现象，这与夏秋季节个别白玉兰植株提早落叶并开花现象极为类似。众所周知，叶枯萎、落叶往往与高温、低温或干旱脱水引起的胁迫反应有关，胁迫反应与激素调控存在某些交叉通路，比如在番茄研究中发现，受细胞分裂素诱导表达的下游基因也同时受低温冷胁迫、干旱脱水胁迫等的诱导。模式植物拟南芥研究中发现，春化、温度、年龄与赤霉素途径是通过促进或抑制共同的下游开花整合基因SOC1基因，进而调控花分生组织基因AP1、CAL、FUL、LFY表达而诱导开花，SOC1基因的增强表达受高温和赤霉素共同诱导。同样，转录组分析发现光周期、春化、年龄和赤霉素通路均参与到对‘红元宝’紫玉兰两次花芽分化的成花调控中。温度、赤霉素共同参与了白玉兰的开花诱导调控，并可能与胁迫反应存在交叉通路，这再次证明了植物开花遗传调控通路的错综复杂性。有关激素、营养与高温、干旱等环境因子诱导花芽分化及开花的交叉调控，还有待进一步从生理、分子生物学水平进行基因差异表达、代谢组学等研究分析，以揭示白玉兰花芽诱导及开花诱导与调控机制。