论文推荐 || 东北林业大学林学院曹传旺教授团队开展舞毒蛾谷胱甘肽S-转移酶的结构预测及其与杨树次生物质的分子对接分析

经序列比对分析（图1），舞毒蛾GSTo1与家蚕GSTo3（模板编号：3rbt.1.A）氨基酸序列一致性最高，相似度59%，模板覆盖率100%；舞毒蛾GSTo2氨基酸序列与家蚕GSTo2（模板编号：3wd6.1.A）一致性最高，相似度为41%，模板覆盖率为93%；搜索到LdGSTs1和LdGSTs2氨基酸序列一致性最高的模板为德国小蠊（Blattella germanica）Blag5（模板编号：4q5r.1.A），相似度分别为36%和40%，模板覆盖率均为93%；搜索到LdGSTt1氨基酸序列一致性最高的模板是人类Homo GSTt1（模板编号：2c3n.1.A），相似度为38%，模板覆盖率为95%；搜索到LdGSTz1和LdGSTz2氨基酸序列一致性最高的模板是人类HomoGSTz1（模板编号：1fw1.1.A），相似度分别为46%和40%，模板覆盖率分别为100%和97%；搜索到LdGSTe1、LdGSTe2和LdGSTe3氨基酸序列一致性最高的模板是黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）GSTe7（模板编号：4png.1.A），相似度分别为37%、38%、42%，模板覆盖率分别为95%、96%、96%；以上GSTs模板均符合Swiss-model同源模建序列一致性及模板覆盖率条件，基于上述模板构建了舞毒蛾GST同源蛋白三维结构模型（图2）。

舞毒蛾10个GST蛋白结构是二聚体，包含a链和b链，具有β折叠和5~6个α-螺旋，从而稳定GST整体结构。分析表明建模所得舞毒蛾10个GST三维结构模型均具有该典型结构（图2）。

2.3.1 GST模型的Procheck评价

 所得的拉氏构象图中LdGSTe1、LdGSTe2、LdGSTe3、LdGSTo1、LdGSTo2、LdGSTs1、LdGSTs2、LdGSTt1、LdGSTz1和LdGSTz2的全部氨基酸均位于合理区，满足拉氏构象图中氨基酸位于最佳合理区的数量大于90%的条件，表明所构建舞毒蛾GST模型的氨基酸残基构象是合理的（表1），可用于接下来的分析预测。

 2.3.2 GST模型的Verify_3D和ERRAT评价

 通过Verify_3D程序分析表明，LdGSTe1、LdGSTe2和LdGSTe3蛋白三维结构与一级结构的兼容性评分大于0.2的氨基酸残基分别为80.30%、81.35%和86.38%；LdGSTo1和LdGSTo2三维结构与一级结构的兼容性评分大于0.2的氨基酸残基分别为97.17%和94.12%；LdGSTs1和LdGSTs2中88.06%和97.52%的氨基酸残基的三维结构与一级结构的兼容性评分大于0.2；LdGSTt1中84.11%的氨基酸残基的三维结构与一级结构的兼容性评分大于0.2，LdGSTz1和LdGSTz2中87.5%和81.95%的氨基酸残基的三维结构与一级结构的兼容性评分大于0.2。因此，LdGST氨基酸数量均大于80%，故建模的氨基酸残基结构合理。

 通过ERRAT程序评价可知LdGSTe1、LdGSTe2和LdGSTe3的ERRAT值分别为96.61%、95.34%和93.4%；LdGSTo1和LdGSTo2的ERRAT值分别为95.92%和97.82%；LdGSTs1和LdGSTs2的ERRAT值分别为94.29%和94.32%；LdGSTt1的ERRAT值为95.86%；LdGSTz1和LdGSTz2的ERRAT值分别为91.73%和92.62%。评价这10个GST模型所得到的ERRAT值均远大于50%，故构建GST蛋白模型中的非键合相互作用整体上是合理的。

2.4.1 分子对接结合能分析

 采用分子对接分析舞毒蛾10个GST与6种杨树次生物质的结合方式结果（表2）表明：与水杨苷结合的最佳蛋白为LdGSTs2，结合能为-45.70 kJ/mol；与咖啡酸结合的最佳蛋白为LdGSTz2，结合能为-43.96 kJ/mol；与邻苯二酚和芦丁结合的最佳蛋白为LdGSTz1，结合能分别为-25.85和-95.46 kJ/mol；与黄酮结合的最佳蛋白为LdGSTe2，结合能为-32.49 kJ/mol；与槲皮素结合的最佳蛋白为LdGSTo2，结合能为-62.09 kJ/mol。从结合能来看，10个GST蛋白的结合能趋势基本一致，其中与GST结合最好的杨树次生物质是芦丁，其次是槲皮素、水杨苷、咖啡酸、黄酮和邻苯二酚。与杨树次生物质结合最佳的蛋白为LdGSTz1，结合最差的蛋白为LdGSTo2。

 2.4.2 LdGSTs2蛋白的结合分析

 以Docking-score评价对接效果分析表明水杨苷与LdGSTs2结合特性最好（表2）。水杨苷位于LdGSTs2的α螺旋形成的结合腔内，周围分子作用较为紧密，LdGSTs2中的天冬氨酸（ASP）97A、丝氨酸（SER）100B、SER100A、赖氨酸（LYS）101B、酪氨酸（TYR）96A、甲硫氨酸（MET）14A、SER64A、天冬酰胺（ASN）65A和丙氨酸（ALA）66A通过范德华力与水杨苷结合；ASP97B通过阴离子-π键与水杨苷结合；ASP97B、精氨酸（ARG）99A、谷氨酰胺（GLN）63A和ASP93B通过常规氢键与水杨苷结合。通过氢键结合的这些氨基酸说明疏水性的残基与水杨苷之间的氢键以及作用力均为促进蛋白-配体结合的主要作用力(图3)。

 2.4.3 LdGSTz1蛋白的结合分析

 邻苯二酚和芦丁与LdGSTz1结合特性最佳（表2）。邻苯二酚位于LdGSTz1 α-螺旋形成的结合空腔内，周围分子作用较为紧密，对接结果（图4和图5）可知，LdGSTz1中的GLN56B、SER12B、SER13B、GLN109B、GLN112B、ASN170B、ARG173B、亮氨酸（LEU）11B4和ASN113B与邻苯二酚通过范德华力结合，LEU36B和半胱氨酸（CYS）14B与邻苯二酚通过π-烷基结合。氢键作用力的氨基酸残基为缬氨酸（VAL）57B，说明在LdGSTz1中这些疏水性残基与邻苯二酚的作用力和氢键作用力是促进蛋白-配体结合的主要作用力。

 芦丁位于LdGSTz1 α-螺旋形成的疏水口袋内，周围分子作用紧密，脯氨酸（PRO）110B和CYS14B与芦丁通过烷基结合；ASN113B与芦丁通过π-孤对电子结合；组氨酸（HIS）44B、GLN43B、VAL115B和GLN56B通过不利键与芦丁结合；VAL115B与芦丁通过π-烷基结合；SER105B、SER106B、SER106A、ARG17B、GLU55B、SER70B、GLU102A、PRO58B、VAL103A、LEU111A、异亮氨酸（ILE）108A、VAL116B、甲硫氨酸（MET）54B、色氨酸（TRP）132A、SER15B、ARG135A、LEU16B、LEU114B、ILE118B和甘氨酸（GLY）40B与芦丁通过范德华力结合；GLN109B、GLY107A、GLU69B、CYS14B、VAL57B、GLN56B和SER13B与芦丁通过氢键结合；SER12B、LEU111A和GLU69B与芦丁通过碳氢键结合，在SER12B、LEU111A和GLU69B以碳氢键的形式形成氢键。氢键是一种较强的分子间作用力，氢键作用使得蛋白-配体结合更加稳固，所以SER12B、LEU111A和GLU69B是关键位点。

 2.4.4 LdGSTz2蛋白的结合分析

 咖啡酸与LdGSTz2结合特性最好（表2），咖啡酸位于LdGSTz2 α-螺旋形成的疏水口袋内，周围分子作用紧密，LdGSTz2中的VAL59B、ASN115B、GLN111B、ASN173B、PHE116B、GLY117B、PHE46B、ARG138A和ALA56B与咖啡酸通过范德华力结合；CYS17B、SER16B、GLN45B和GLN57B与咖啡酸通过氢键结合；LYS58B和ILE39B与咖啡酸通过π-烷基结合；SER15B与咖啡酸通过碳氢键结合，SER15B以碳氢键的形式形成氢键，所以SER15B是一个关键位点（图6）。

 2.4.5 LdGSTe2蛋白的结合分析

 黄酮与LdGSTe2结合特性最好（表2），黄酮位于LdGSTe2 α-螺旋形成的结合腔表面，LdGSTe2中的ASN131B、ALA119A、VAL115B和GLU114A与黄酮通过范德华力结合；LYS130B和PRO118A与黄酮通过π-烷基结合；ARG111B与黄酮通过阳离子-π键结合，黄酮与LdGSTe2以分子间作用力结合，并未形成氢键，说明促进蛋白-配体结合的主要作用是疏水作用力（图7）。

 2.4.6 LdGSTo2蛋白的结合分析

 槲皮素与LdGSTo2结合特性最好（表2），槲皮素位于LdGSTo2 α-螺旋形成的结合腔表面，LdGSTo2中的ALA230A、ALA126A、PRO130A、LEU181A和LYS186A与槲皮素通过范德华力结合；SER129A与槲皮素通过π-孤对电子和氢键结合；ILE184A与槲皮素通过π-烷基结合；ALA125A和GLY185A与槲皮素通过氢键结合，说明这些疏水性残基与水杨苷的作用力和氢键作用力为促进蛋白-配体结合的主要作用力（图8）。

利用分子对接能够快速分析GST的结合情况，直观地显示出与次生物质的结合模式，并且可以在短时间内对大量结果进行比较，使研究结果更具有针对性。本研究选择10种舞毒蛾GST和6种杨树次生物质进行分子对接，分析舞毒蛾GST的结合能、关键氨基酸以及结合方式，可知不同舞毒蛾GST与杨树次生物质的结合区域相似，同种杨树次生物质与不同GST的结合能相似，表明GST对次生物质特异性不高。GST与杨树次生物质通过氢键和共价键的方式结合，结合相对稳定，结合能差异较大（-12.67~-95.46 kJ/mol），表明6种次生物质与10个GST结合能力较好，具有较好的亲和力。Lu等、崔琳琳等、马天翔等研究表明，蛋白质与小分子结合能<0 kJ/mol能自发结合，蛋白质与小分子结合能≤-5 kJ/mol则结合能力较好。沃格特提出在气味受体、气味结合蛋白和气味降解酶3种蛋白质中，气味降解酶中的两类家族基因（CYP450和GST）可能是特异性最低的，为更具针对性的行为抑制蛋白。Gawande等将棉蚜（Aphis gossypii）GST蛋白（AgosGSTs1和AgosGSTs2）分别与植物次生物质进行分子对接，结果显示与单宁酸和鞣花酸结合时具有相似的结合能和氢键得分，表明两种GST对同一分子的特异性不高，但具有较好的结合能力。杨欢等将禾谷缢管蚜GST蛋白（RpadGSTs1和RpadGSTd1）分别与12种化合物进行分子对接，结合能为-14.77~-39.54 kJ/mol，表明GST与12种化合物能够自发结合且结合能力较好；同种化合物与两种GST对接的结合能相近，结合区域相似并且具有促进稳定结合的分子间作用力。

 本次研究与上述结果类似，所选GST与配体结合过程中，不同的GST对相同的杨树次生物质结合差异不大，这与其他特异性较强的蛋白相比明显不同。通过GST与以往研究最多的OBP进行比较，GST与OBP和配体结合的原理存在差异。结构相似的次生物质与GST蛋白的结合位点、形成的化学键以及分子间作用力差异很小，反之，OBP蛋白与配体结合会因结构、化学键以及分子间作用力的不同而产生较大的差异；然而，GST蛋白结构相似，与配体结合能力趋于稳定。根据GST的特异性较低这一特性，筛选与GST能够结合的物质的范围更大，更容易筛选出可以与GST结合的物质。在蛾类的杀虫剂研制防治中，可以添加更易与GST结合的化合物，根据底物竞争结合原理，使GST优先与该物质结合，从而降低害虫对杀虫剂的抗性，增强杀虫剂的杀虫作用。然而，本研究所用分子对接技术，属于计算机模拟预测，其预测结果可能与试验结果存在差异性，还需进一步验证。

 综上所述，利用分子对接模拟了舞毒蛾GST与杨树次生物质的作用模式，为后续舞毒蛾GST对不同次生物质的解毒能力分析，以及根据次生物质与GST结合能力的强弱选择杀虫剂增效剂，从而增加舞毒蛾的防治效果提供了理论基础。