论文推荐 || 南京林业大学彭冶副教授团队研究铁冬青花挥发性化合物对中华蜜蜂访花的影响

关键词：铁冬青; 中华蜜蜂; 挥发性有机化合物; 传粉昆虫; 气相色谱-质谱联用技术

基金项目：江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)。

引文格式：匡泽宇,彭冶,方类明.铁冬青花挥发性化合物对中华蜜蜂访花的影响[J].南京林业大学学报(自然科学版),2024,48(4) :254-260.KUANG  Z Y, PENG Y, FANG Y M. Effects of volatile organic camponents of Ilex rotunda on its insect pollinator,Apis cerana[J]. Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition),2024,48(4):254-260.DOI:10.12302/j.issn.1000-2006.202211014.

试验地位于江苏省南京市(118°46'5.53″E，31°52'11.10″N)，属北亚热带湿润气候，四季分明，雨量充沛，土壤肥沃。年平均降水117 d，平均降水量1 106 mm，相对湿度76%，无霜期237 d。试验所用铁冬青花蕾及花，采自南京林业大学校园内多年生栽培群体，生长环境一致且健康。为了测试不同阶段的挥发性成分，花蕾及花收集于4个阶段:①大蕾期，花苞饱满，顶端出现孔隙，即将开放；②初绽期，花被片张开，雄蕊尚未开始散粉，雌蕊柱头可授；③盛花期，花冠完全打开，花瓣伸展；④末花期，花被片开始萎蔫，有少量落花(图1)。为使分析结果更具代表性，选择晴朗天气的13:00—14:00，分别从雌雄株采集4个时期花蕾及花，每个时期取3个重复用于检测挥发性成分。

挥发性成分萃取:将65 μm PDMS/DVB萃取头与SPME手柄(美国SU-PELCO公司)进行连接，在气相色谱的进样口进行老化，老化温度为250 ℃，老化时间30 min。每次取长势、大小一致的花瓣1 g放置于10 mL萃取瓶中并密封，于恒温水浴锅下(40 ℃)平衡25 min；将经过老化的SPME纤维头插入采样瓶中，萃取头置于花朵上方1 cm处，顶空萃取25 min；最后将萃取头插入GC进样口，解析3 min，进行GC-MS(气相色谱质谱联用仪，美国Thermo Electro-Finnigan公司)技术分析。

色谱条件:TTR-5MS弹性石英纤维毛细管柱；载气为高纯度氦气(He)，氦气流速为1 mL/min，分流比为10∶1，进样口温度250 ℃；升温程序为初始温度40 ℃，保持2 min；以2 ℃/min升至60 ℃，以5 ℃/min升至100 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

质谱条件: 接口温度为250 ℃，电子轰击源为EI，离子电离能量为70 eV，质量扫描范围50~450 amu。

对雌雄株的主要传粉昆虫种类、数量及其访花行为进行观测。标记雌雄株各3株，每株选取3个花枝，在4月26日至5月9日整个花期内晴天8:00—18:00进行观察，记录在花上访问的昆虫种类与数量以及访花行为。每2 h观察1次，每次记录30 min，每天观察5次。累计观察30 h。

依据GC-MS的总离子流图，对照图谱库(NIST05)的标准质谱图，确认挥发性物质的各化学成分，并按峰面积归一化法计算出样品中各组分的相对含量(体积分数)。

对铁冬青的挥发性成分进行相似度分析，引入Jaccard相似性系数(q): q=c/(a+b-c)。式中: c为雌雄株共有挥发性成分种数；a和b分别为雌株和雄株的挥发性成分种数。q为相似性系数，当0≤q≤0.25时，雌雄株间的挥发性化合物极不相似；当0.25<q≤0.50时，中等不相似;当0.50<q≤0.75时，中等相似；当0.75<q≤1.00时，极相似。

采用SPSS 26.0处理数据。运用Origin 2022绘制PCA得分图和表格，显著性水平均为0.05。采用在线软件TBtools (https://github.com/CJ-Chen/TBtools) 制作挥发性成分和昆虫访花频率的热图。

利用HS/SPME-GC/MS分别对铁冬青花的4个阶段进行挥发性有机化合物检测，在整个花期雌雄花共检测出30种挥发性物质，其中雌花检测出19种，雄花21种(表1)。雌花4个阶段检测出19种挥发性有机化合物，包括萜烯类、烷烃类、酯类、醇类和其他5大类。其中萜烯类成分的种类最丰富，各阶段都有4~5种且总含量一直远高于其他种类化合物。其次是烷烃类(2~5种)和醇类(2~3种)，其余化合物仅在特定阶段出现，如酯类仅在末花期测出，乙醇胺仅在大蕾期测得，丙氨酰、丙氨酸在大蕾期和盛花期出现。纵观整个花期，各类挥发性有机化合物的含量变化呈现不同趋势。主要成分萜烯类呈现先上升再下降的趋势，在盛花期达到最高；相反，醇类物质含量为先下降后上升,在末花期达到峰值。酯类、乙醇胺等其他物质的体积分数占比在4个阶段中均不超过2%，变化不大。雄花在4个阶段检测出21种成分，主要是萜烯类、烷烃类、醇类和醛类。大蕾期检出7种化合物，包括6种萜烯类和1种醇类，萜烯类体积分数占比在此阶段达最高值，为98.19%。至花初绽，雄花释放的成分略有增多，有5种萜烯类和6种烷烃类。醛类化合物仅在末花期检测出。与雌花不同，雄花萜烯类含量在大蕾期就达到峰值，而不是盛开期。前3个阶段，雌雄花萜烯类含量的差别很小，但到末花期，雄花萜烯类体积分数占比仍达到82.51%，而雌花仅剩70.31%；除此之外，醇类是雌花末花期含量第二高的化合物，体积分数占比19.84%，雄花则是烷烃类，体积分数占比14.07%。

对于雌雄异株植物而言，雌雄花的挥发性成分相似性高则有助于吸引相同的访花昆虫。铁冬青雌花雄花的挥发性有机化合物相似度分析结果显示，从全花期角度看，雌雄花的总成分相似度为0.38，处于中等不相似水平，但变化趋势是先增高后降低，初绽期和盛开期多处于中等相似水平。萜烯类与烷烃类是种类数量较多的两类化合物，其相似度变化规律与总成分相似，初绽期和盛开期的相似度高于其他阶段，烷烃类全花期的相似度达到了0.71，成为铁冬青花期挥发性成分相似度最高的化合物。

分析得知(表1)，雌花和雄花在4个阶段内，萜烯类的含量都显著高于其他大类，而在萜烯类中，β-石竹烯的含量又始终占主导地位。雌花在大蕾期含量最高的3种化合物为β-石竹烯、α-石竹烯、氧化石竹烯，体积分数分别为81.78%、4.95%和4.31%，总含量超过90%；其次为十四甲基环七硅氧烷(2.23%)、环己硅氧烷(1.55%)和丙氨酰丙氨酰丙氨酸(1.34%)，同时检测出仅存于此阶段的乙醇胺(0.87%)。初绽期氧化石竹烯的体积分数下降至0.84%，十四甲基环七硅氧烷的体积分数上升至5.45%。初绽期至末花期，主成分β-石竹烯含量体积分数先升高后降低，盛花期达到峰值89.07%，末花期最低仅60.53%。盛花期未检测出醇类物质，而在末花期醇类总体积分数却达到了20%左右。此外末花期新检测出2种罗勒烯和酯类的格拉菲宁，各萜烯类化合物含量下降，醇类与烷烃类的种类和占比为整个花期最高。

雄花大蕾期含量最高的化合物分别是β-石竹烯、α-石竹烯和α-法尼烯，其体积分数分别为70.89%、16.92%和4.46%，此阶段独有的榄香烯体积分数约为1.07%。初绽期萜烯类中除了β-石竹烯含量继续上升，其他种类占比都下降，最明显的是α-石竹烯下降至4.54%；初绽期烷烃类种类最多有6种，其中环己硅氧烷、十四甲基环七硅氧烷、十六烷基环八硅氧烷3种体积分数超过1%。盛开期β-石竹烯体积分数达到最高值为92.68%，其他已有的成分占比皆下降。末花期化合物种类最多，各成分含量较为分散，新检测出蒎烯、Hexyl hydroperoxide等物质，除β-石竹烯外，环己硅氧烷和十四甲基环七硅氧烷为含量最高的两种成分，体积分数分别达到6.72%和5.12%。

PCA分析结果(图2)表明，雌花和雄花第1主成分(PC1)的贡献率加上第2主成分(PC2)的贡献率均大于90%，说明第1、第2主成分基本代表了样品主要挥发性有机化合物的组成，达到了降维目的并依此分类。经分析，对于雄花，与PC1相关性高的变量为β-石竹烯、α-石竹烯和α-法尼烯，可以区分出末花期；与PC2相关性高的变量为α-石竹烯、十四甲基环七硅氧烷和环己硅氧烷，可以区分出大蕾期。而初绽与盛花期在PC1和PC2上的差距较小。对于雌花而言，与PC1相关性高的变量为β-石竹烯、反-α反-α，α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇和壬三烯，可显著区分大蕾期末花期与初绽盛花期；与PC2相关性高的变量为十四甲基环七硅氧烷、反-α反-α，α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇和α-石竹烯，可以进一步区分大蕾期和末花期。综上所述，通过β-石竹烯、α-石竹烯等萜烯类和十四甲基环七硅氧烷、反-α反-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化-2-呋喃甲醇等烷烃类的含量差别可以有效推断花期进程，这也从侧面证明了这些挥发性成分在开花进程中有各自的变化趋势。

依据对铁冬青整个花期(4月24日—5月8日)的观测以及鉴定结果可知，铁冬青的传粉昆虫种类较为单一，主要是中华蜜蜂(Apis cerana)。随着开花进程的推进，中华蜜蜂的访问频率在初绽期(4月24日—4月27日)开始有上升的趋势(图3)，一直到盛花期(4月28日—5月3日)达到峰值，随后进入末花期(5月4日—5月8日)转为下降。中华蜜蜂的访花变化与主要的挥发性化合物β-石竹烯先增后减的趋势一致，雌株与雄株呈现出相似的规律，但雄株的中华蜜蜂访问量始终大于雌株，并且整个花期内雌雄株被访问的高峰期高度重叠，这也从侧面体现了铁冬青雌雄株花期同步，这对成功授粉十分有利。

中华蜜蜂访问铁冬青花热图见图4。

热图分析(图4)显示，除去4月25日和4月28日两个雨天，在上午时间段，中华蜜蜂的访问量持续上升，10:00—12:00是全天访问频率最高的区间，14:00—16:00出现第2个高峰，符合中华蜜蜂“双峰格局”的访花规律。值得注意的是，12:00—14:00时间段，即使天气晴朗温度高，其访问量却不如前后观测段，可能是蜜蜂访花行为还受到温度与湿度的影响，不适宜的温湿度会降低中蜂的访问频率。在观测中还注意到，中华蜜蜂访花时身体会充分接触雄蕊，体表携带大量花粉。中华蜜蜂携粉部位主要位于喙部、足与腹板。偏爱“集中式”访花的中华蜜蜂在1个花枝上连续访数朵花，通常在访完整个花枝所有花朵后才转移至其他花枝，且会出现重复访同一朵花的现象。同有关研究，中华蜜蜂偏向于上午访花采粉，下午访花采蜜。这既解释了中华蜜蜂对花量更大、开放更集中的雄株的访问量远大于雌花，也佐证了铁冬青是优良的蜜源植物，以花粉和花蜜作为访花的报酬。

随着花开放和衰败，植物的挥发性有机化合物释放都会发生相应改变。本研究中，铁冬青花的主要挥发性成分为萜烯类，包括β-石竹烯、α-石竹烯、α-法尼烯和氧化石竹烯等，变化趋势均为先增加后减少，盛花期达到峰值。尽管雌雄花的挥发性成分总体呈中等不相似水平，但β-石竹烯始终是含量占比(体积分数)最高的化合物，在PCA分析中也是相关度最高的物质。Kantsa等提出芳香植物萜类化合物的高排放量与蜜蜂的高访问量有关。倍半萜(sesquiterpene)是天然植物群落中挥发性有机化合物(VOC)的主要组分，β-石竹烯是倍半萜，在昆虫-VOC网络中起关键作用。Schiestl的分析显示，作为昆虫信息素的半萜与作为花挥发物的半萜存在90%的重叠。吴国火等证实低浓度β-石竹烯和α-法尼烯对中华蜜蜂具有显著引诱效应。铁冬青开花过程中β-石竹烯的变化规律与中华蜜蜂的访花规律高度吻合，因此，推测β-石竹烯可能作为一种信息物质，吸引中华蜜蜂为铁冬青进行授粉。

对于雌雄异株植物而言，雄花与雌花的访花昆虫应保持相对的一致性。朱晓珍等研究发现，罗汉果(Siraitia grosvenorii)的雌花和雄花在访花昆虫的多样性上存在显著差异，并且雌株上未发现有效传粉昆虫。他们认为这是罗汉果自然授粉不良的主要原因。同时，对于雌雄异株植物，访花昆虫常对雄性个体表现出明显的偏好。而笔者的研究结果表明，铁冬青雌雄花的花期一致，开花过程中释放的挥发性物质较为一致，访花的昆虫一致。已知挥发性物质对传粉昆虫具有特定的导向作用，尽管铁冬青在挥发性成分的种类上呈现中等不相似水平，但在相对含量中，萜烯类特别是β-石竹烯等主要成分高度相似，这有利于传粉昆虫同时对铁冬青雌雄花进行同步的有效访问。对于植物而言，更多的花被传粉昆虫访问，意味着更多的授粉机会与繁殖保障。铁冬青具有雄株花量大、雌雄株花期一致的特点，结合其主要授粉昆虫中华蜜蜂的访花习惯，在栽培时应集中且合理地进行雌株与雄株的搭配,以更大程度发挥对访花昆虫的诱导作用，提高雌株有效授粉，增大果量，提高其观赏性。但是授粉昆虫种类单一，对于植物而言是具有潜在危害的。由于农药的过度使用,栖息地的减少，以及意大利蜂等的竞争，中华蜜蜂的数量增长速度跟不上植物传粉需求，长此以往，可能会制约铁冬青的有性生殖成功率，甚至使其濒临灭绝。因此，后续研究应围绕验证β-石竹烯对中华蜜蜂的引诱效果，分析如何吸引更多种类和数量的授粉昆虫来展开。