专题报道：郑万钧先生诞辰 120周年纪念专题Ⅱ ||南京林业大学陈昕教授团队开展蔷薇科花楸属白毛系的系统发生分析研究

关键词：花楸属；形态特征；质体基因组；系统发生

基金项目：江苏省自然科学基金项目(BK20141472)；江苏高校优势学科建设工程项目(PAPD)。

引文格式：马建慧,陈昕,耿礼阳,等.蔷薇科花楸属白毛系的系统发生分析[J].南京林业大学学报(自然科学版),2024,48(2):61-72.MA J H, CHEN X, GENG L Y, et al. Phylogenetic analysis of Sorbus Ser. Folgnerianae (Rosaceae)[J]. Journal of Nanjing Forestry University(Natural Sciences Edition),2024,48(2):61-72.DOI:10.12302/j.issn.1000-2006.202206003.

第一作者

马建慧，女，南京林业大学林业专业硕士研究生，研究方向为分子系统学。

通讯作者

陈昕，女，南京林业大学教授，主要从事植物分类、观赏植物种质资源收集及开发利用、城市木本植物景观多样性研究。

以白毛系3种棕脉花楸、石灰花楸和江南花楸为研究对象，采集其野生居群的花期和果期标本并拍摄照片，比较其形态特征。凭证标本存放于南京林业大学树木标本馆（NF），采集信息见表1。

1.2.1 实验材料

以白毛系3种花楸为研究对象，以冠萼组的大果花楸（S. megalocarpa）为对照，采集4种花楸野生居群生长健壮、无病虫害植株的新鲜叶片，硅胶干燥后，–80 ℃ 低温保存备用。石灰花楸采集了来自2个居群的样本，棕脉花楸、江南花楸和大果花楸各1个样本，采集信息和GenBank登录号见表1。

1.2.2 DNA提取、检测与测序

采用多糖多酚植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技公司, 北京）提取总DNA，使用 Qubit 核酸蛋白定量仪检测 DNA 质量和纯度，检测合格后利用超声波将其片段化，而后进行片段纯化、末端修复、3′端加A、连接测序接头等操作，再用琼脂糖凝胶电泳选择片段大小，PCR 扩增构建测序文库，最后将合格文库在DNBSEQ平台进行高通量测序。

1.2.3 基因组组装与注释

以Sorbus torminalis（NC_033975.1）为参考序列，使用Get Organelle1.7.5.3程序对原始数据进行组装，参数修改为适合花楸属的数值（wordsize = 103；base coverage= 171.44；k=75、85、95、105、115、127）。将组装好的序列利用Bandage0.8.1软件进行可视化处理并过滤。以天山花楸（S. tianschanica; ON049666）为参照，使用PGA软件和Geneious11.0.3软件完成质体基因组注释。通过Geneious11.0.3软件修正注释序列获得最终结果，提交至GenBank。使用OGDRAW（https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）绘制质体基因组图谱。

1.2.4 SSRs与散在重复序列分析

使用MISA软件（https://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）检测5个样本以及从NCBI中下载的石灰花楸（MK161058）的SSRs数量和位置分布，单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核甘酸、五核苷酸、六核苷酸重复次数依次设置为12、6、4、3、3、3。使用REPuter软件（https://bibiserv.cebitec.uni-bie lefeld.de/reputer/）分析重复序列，包括正向（forward repeats）、反向（reverse repeats）、回文（palindromic repeats）和互补序列（complement repeats），设置最小重复大小为30 bp，Hamming距离3，序列同源性90%，e-value值均小于10^-5。

1.2.5 序列分化分析

使用mVISTA软件（http://genome.lbl.gov/vista/mvista/ instructions.shtml）中的Shuffle-LAGAN程序，以康藏花楸（Sect. Aria）质体基因组序列为参照，对5个样本以及NCBI中下载的花楸属6个组物种：石灰花楸（MK161058）、水榆花楸（S. alnifolia；MZ145061.1；Sect. Micromeles）、S. aria（NC_045418.1；Sect. Aria）、S. chamaemespilus（NC_045419.1；Sect. Chamaemespilus）、S. domestica（KY419956；sect. Cormus）、卷边花楸（S. insignis；NC_051947.1；Sect. Sorbus）、鼠李叶花楸（S. rhamnoides；KY419962；Sect. Micromeles）、S. torminalis（NC_033975.1；Sect. Torminalis）共14个质体基因组序列进行比对，检验序列差异性。使用IRscope软件（https: //irscope.shinyapps.io/irapp/）分析上述14个序列、苹果亚科的湖北海棠和李亚科的桃（Prunus persica；OK545754.1）共16个序列的IR边界收缩和扩张情况。

使用 MAFFT7.037 软件，以Barbeya oleoldes（Barbeyaceae）为外类群，以本实验的5个样本数据为基础，从NCBI中下载花楸属6个组、苹果亚科其他属、蔷薇科其他亚科代表种共46个质体基因组数据，进行序列比对。采用最大似然法（ML）和贝叶斯法（BI）构建系统发生树，进行系统进化分析。使用RAxML8.0.0软件(m=GTR+GAMMA)完成ML分析；将MrModel test3.7软件构建的模型导入MrBayes3.2.2 软件完成BI分析。ML和BI的分析结果用FigTree1.4.3软件(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)进行可视化处理。

白毛系的棕脉花楸、石灰花楸和江南花楸均为落叶乔木，叶均为卵形至椭圆状卵形，侧脉均直达叶边齿端，叶背密被毛。但棕脉花楸和石灰花楸叶背密被白色毛，而江南花楸密被灰白色毛。3种植物在叶柄、叶背中脉和侧脉毛被上差异显著：棕脉花楸均被棕色毛（图1a）、石灰花楸均被白色毛（图1b）、江南花楸则光滑无毛（图1c）。从花序及花特征上看，棕毛花楸（图1d）花序被棕色毛，石灰花楸（图1e）和江南花楸（图1f）花序被白色毛；棕毛和石灰花楸花柱2枚、花药黄白色，而江南花楸花柱3 ~ 4枚、花药紫红色。果实特征也易于区分，棕脉花楸（图1g）和石灰花楸（图1h）花部均脱落、果实顶端留有圆穴，但前者果实近球形、后者果实卵球形；江南花楸果实形状同棕脉相似，但其花萼、雄蕊、花柱宿存（图1i）。

2.2.1 基因组基本特征

白毛系棕脉花楸、石灰花楸（两个体）、江南花楸及大果花楸4种共5个样本的质体基因组特征比较见图2和表2。5个样本的质体基因组全长介于159 781（江南花楸）~ 160 755 bp（石灰花楸-ON262429）。石灰花楸的两个体相差124 bp，均较另4个种长。均具有双链环状四分体结构，包含一个大单拷贝区（LSC）、一个小单拷贝区（SSC）和两个反向重复区（IRa/IRb）。LSC、SSC、IR区长度分别为87 713 ~ 88 483 bp、19 304 ~ 19 480 bp和26 404 ~ 26 410 bp。5个样本的编码区长度占比为56.26% ~ 56.58%，非编码区长度占比为43.42% ~ 43.74%。GC含量差异不大，石灰花楸和江南花楸最小，2个种均为36.4%，棕脉花楸为36.5%，大果花楸为36.6%；LSC和SSC区的种间差异也仅为0.2%和0.1%；5个样本CDS、rRNA、tRNA 3个区的GC含量则完全相同，分别为37.7%、55.6%和53.3%。

5个样本均注释到113个unique基因，包括蛋白编码基因79个、tRNA基因30个、rRNA基因4个。19个基因在IR区复制，基因总数达132。有18个基因含有内含子，其中16个基因（trnA-UGC、trnG-UCC、trnI-GAU、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC、ndhA、ndhB、petB、petD、rpl16、rps12、rpoC1、rps16、rpl2、atpF）含有 1 个内含子，2 个基因（clpP和ycf3）含有 2 个内含子，含内含子的基因中有6个为tRNA基因。根据基因功能可将基因分为 3 类，其中与光合作用相关的基因44个，与自我复制相关的基因59个，其他编码蛋白质的基因6个以及未知功能基因4个（表3）。

2.2.2 SSRs和散在重复序列分析

基于实验的5个样本及石灰花楸（MK161058）的MISA分析结果见图3a—3c。6个序列的SSRs介于48（大果花楸）~ 54（石灰花楸-ON262428）之间。SSRs以单核苷酸为主，占66.67%~ 72.92%，且偏向使用A/T碱基。单、四核苷酸数量远高于二、三、五核苷酸，均不含六核苷酸（图3a）。单核苷酸棕脉花楸、江南花楸和大果花楸均为35，石灰花楸3个样本均为36；四核苷酸数目为9~14，二核苷酸为2或3，江南花楸不含三核苷酸，其他样本为1或2，江南花楸和大果花楸不含五核苷酸，其他样本均有1个五核苷酸。基因间区、外显子区和内含子区均有SSRs分布，且基因间区的SSRs占比最高，为77.08%~ 87.04%（图3b）。LSC区的SSRs占比在80.39% ~ 84.31%之间，远高于SSC区（11.76% ~ 13.46%）和IRs区（3.70% ~ 7.84%）（图3c）。

基于REPuter检查结果见图3d—3e。6个质体基因组的散在重复序列数量介于36（大果花楸）~ 49（石灰花楸、江南花楸）之间。正向、反向、回文、互补4种序列的数量变异区间分别为：15 ~ 26、7 ~ 14、9 ~ 15和1~2，正向序列最普遍（图3d）。重复序列长度变化在30 ~ 127 bp之间，主要位于30 ~ 40 bp之间（图3e）。6个质体基因组的ycf1、trnS-GUC、trnS-GGA编码区和clpP、ycf3和ndhA的内含子上均有重复序列分布。此外，白毛系4个样本的rpl32编码区、大果花楸的trnK-UUU和atpF的内含子上、除大果花楸以外5个样本的trnG-UCC 的内含子上也有分布。

2.2.3 基因组序列变异分析

白毛系同花楸属另9种植物共14个序列不同区域的比较显示：编码区较非编码区、IR区较LSC/SSC 区更为保守（图4）。20个非编码区表现出高分化度，其中17个位于基因间区，分别是：trnK-rps16、trnR-atpA、atpF-atpH、trnC-petN、petN-psbM、psbM-trnD、trnT-psbD、psbZ-trnG、trnT-trnL、ndhC-trnV、trnM-atpE、accD-psaI、clpP-psbB、ndhF-rpl32、rpl32-trnL、ndhG-ndhI、rps19-trnH；3个位于内含子区：分别为clpP、rpl16、ndhA。除了ndhF-rpl32、rpl32-trnL、ndhG-ndhI和ndhA位于SSC区，其他非编码区均位于LSC区。

白毛系同落萼组其他种、花楸属另5个组、苹果亚科的湖北海棠以及李亚科的桃共14种植物16个序列IR区边界的收缩和扩展比较见图5。除石灰花楸(MK161058)外，所有序列的LSC/IRb边界均位于rps19基因内，且rps19的5'末端均不同程度扩张进人IRb中，从而在IRa区产生了1个不同大小的rps19 假基因(rps19^Ψ)。rps19^Ψ长度介于120~182bp，桃的最长,鼠李叶花楸和大果花楸为152bp，棕脉花楸、石灰花楸2个样本及水榆花楸的长度均为142bp，江南花楸为146bp，其他序列均为120bp。所有序列的SSC/IRa 边界均位于ycf1基因内，ygf1的5'末端位于IRa内，导致了IRb中ycf1^Ψ假基因(ycf1^Ψ)的产生。ycf1^Ψ长度介于1003~2573bp，桃的最短，石灰花楸(MK161058)的最长，水榆花楸为1221 bp，S.tormm-inalis 为1092 bp，湖北海棠为1 074 bp，其余序列均为 1 083 bp。

以Barbeya oleoldes（Barbeyaceae）为外类群，基于白毛系3种植物、花楸属其他组以及蔷薇科其他属共46个分类群的质体基因组数据，构建了ML和BI系统发生树。两种树的拓扑结构一致，在此仅展示了ML树的结果，并在树上标注了BI树的支持率（图6）。由系统发生树（图6）可见：花楸属为复系，属下6组中的4组：Chamaemespilus、Cormus、复叶组和Torminalis形成了高支持率的单系，但冠萼组与落萼组未形成单系，白毛系亦未形成单系。白毛系的棕脉花楸、石灰花楸与落萼组直脉系（Ser. Alnifoliae）的水榆花楸形成姐妹群，而后与江南花楸聚为一组。冠萼组大果系（Ser. Megalocarpae）的大果花楸和落萼组直脉系的鼠李叶花楸形成姐妹类群，而后与冠萼组康藏系（Ser. Thibeticae）的康藏花楸聚为一组。

花楸属植物的质体基因组在序列结构、基因组成、GC含量等方面具有高度保守性，未出现基因重排或缺失现象，但仍然存在一些具有区分度的显著序列变异，同本属前期研究结果相似。石灰花楸两个样本的基因组长度均较另4个种长，由于重复序列的数量和分布的差异造成了其种内基因组长度的差异高于种间。IR边界的收缩和扩展在一些类群的演化研究中具有重要意义，同Byrsonima属的物种相似，花楸属rps19和ycf1基因向IR区扩展长度不等，产生了rps19^Ψ和ycf1^Ψ 两个长度不一的假基因，且ycf1^Ψ在JSB处的重叠长度在种间亦有一定变化。同蔷薇科及多数被子植物序列进化式样一致，白毛系及其他花楸属植物的非编码区较编码区、LSC/SSC 区较IR区分化度更高。本实验检测出的20个高变区不仅可以用于该属条形码的开发，也可为对该属的系统进化研究提供快捷途径。SSRs在基因间区占比较高、散在重复序列中正向序列最普遍，同陕甘花楸（S. koehneana）和四川花楸（S. setschwanensis）相似。本研究检测到的48 ~ 54条SSRs、36 ~ 49条散在重复序列可用于该属物种的群体遗传学和谱系地理学研究。

基于质体基因组的系统发生分析显示花楸属为复系，同Campbell等、Potter等、Sun等、Ulaszewski等的研究结果一致。本研究中，花楸属Chamaemespilus、Cormus、复叶组和Torminalis 4个组形成了单系；但中国产冠萼组花楸同复叶组的亲缘关系较近，而同欧洲产冠萼组模式种S. aria的亲缘关系较远；中国产冠萼组和落萼组虽然聚为1支，但各自未形成单系，同Li等基于ITS的研究结果一致。本实验中，源自湖北兴山和四川都江堰的2个石灰花楸样本同源自江西庐山的石灰花楸（MK161058）聚在了一起，可见基于质体基因组的系统树构建在花楸属植物系统发生关系理解上的可靠性。棕脉花楸、石灰花楸和江南花楸基于质体基因组的系统发生关系不支持俞德浚和关克俭、Gabrielian和Aldasoro等的分类处理。从形态上看，俞德浚和关克俭将三种植物置于一个系的前提条件“落萼”并不存在，因为江南花楸果期花萼宿存。

花楸属是蔷薇科分类最为困难的属之一，属下分类一直存有争议，本研究中落萼组和冠萼组未形成单系，白毛系和直脉系亦未形成单系，分类学者基于形态和分子的系统研究尚未达成一致，因而花楸属物种的系统关系确立需要基于更广泛的属内物种、同一物种不同居群的取样，需要更综合的形态及分子数据。