引物的状态 |
引物成品的初始形态均为干粉,如果合成量足够多,能够在管底看到透明或类白色的粉末或薄片。引物生产经过合成、纯化、分装、检测等一系列步骤后,引物离心浓缩干燥成半透明或不透明片状、粉状或球状物质。因为各种纯化工艺不同其干燥后的状态也会有差异。干燥后的引物质地非常疏松,极易溶解。
有时候由于分装体积量较大或者离心干燥时的温度、真空度和时间不同,引物干燥后会贴在管壁四周,虽然形态不规则, 但不影响正常溶解。当引物序列中的 A 和 G 含量较高,OD 值较大,有硫代修饰或者复杂结构时,引物干燥后通常会呈 现黄褐色,这与引物碱基组成和制备过程有关,不会对实验产生影响。
离心 |
拿到新合成的管装干粉状引物之后,首先要进行简单离心。离心前切勿开盖,以避免在运输过程中从管底脱落下来的引物干粉溢出。推荐的离心条件为:使用桌面型离心机4000rpm,离心30~60s。这样既可以将剥离的粉末离心回管底, 又不会因为离心力过大造成离心管破裂;96/384 孔板干粉状引物以金属铝箔封膜密封,开封前建议使用多孔板离心机4000rpm,离心30~60s后,从多孔板四角揭开铝箔封膜。注意动作小心轻柔,避免引物干粉溢出,从而造成孔与孔之 间交叉污染。
溶解引物 |
建议引物使用TE buffer溶解,TE buffer的组分为 10 mM Tris, 1 mM EDTA(pH 8.0)。Tris是一种良好的缓冲系统,能够维持稳定的弱碱性pH环境。EDTA是一种二价金属离子螯合剂,能够螯合溶液中的Mg2+,抑制核酸酶的降解作用,但高浓度的EDTA同样会干扰后续相关实验,如PCR和测序。因此,为了后续实验的正常进行, 建议使用 TE 配制母液,用水稀释工作液,或者使用 0.1X TE buffer配制工作液。理论上,使用无核酸酶的水溶解引物是可以的,但其 pH 很难保持稳定,因此需要保证其 pH≥7.0 才可以。使用DEPC处理水进行引物的配制溶解是非常不推荐的。DEPC(焦碳酸二乙酯)能够与RNase的活性基团进行反应从而 抑制其活性,用来防止RNA降解。而常规的引物属于单链DNA,因此是没有必要用到DEPC的,并且,DEPC 在高温高 压处理时能够降解产生CO2,降低水的 pH 值,对 DNA 的保存是不利的。所以不推荐使用 DEPC 水溶解引物,除非您的后续反应体系中有RNA 参与(如配制逆转录引物)。qPCR过程也不推荐使用DEPC水,因为到qPCR步骤时,抽提的RNA已经经过了逆转录步骤转变为 cDNA,qPCR体系已经跟RNA没有任何关系了。
配制浓度 |
引物在不同的浓度范围内都是比较稳定的,配制的浓度可以由使用者根据自己的实验要求自行决定,但总体上浓度不要低于1μM、不要高于1mM。推荐的标准母液浓度为100μM,这个母液可以很方便地配成各种不同浓度的工作液,比如常规PCR引物只需将母液再稀释10倍即可。合成报告单一般给出了每OD引物稀释为 100μmol/L(即100pmol/μl)浓度的加水量,可以根椐您的实验需要加入适量的缓冲液。
引物溶液的保存 |
通过检测引物处于不同温度下的稳定性,储存引物的最佳温度为-20°C。在此温度条件下,已经溶解在TE缓冲液中的液体引物可以获得至少6个月的有效期;而干粉引物,可以获得至少12个月的有效期。引物在4°C温度下至少能够维持一个月的时间,不推荐在更高的温度下保存引物,其降解速率会明显升高。虽然推荐将引物溶液储存在-20°C,但是再次使用时需要将其完全融化,切勿未融化完全就吸取。需注意的是,反复冻融会降低引物的纯度,因为体系物理状态的改变会加速引物的降解。所以推荐先配制母液后稀释配制工作液的使用方法,如果引物要在短时间内反复使用,建议将母液放置于-20°C,工作液可以放在4°C。对于有荧光标记的引物如探针,还需要做额外的避光处理。通常情况下,TE储存的荧光标记引物在-20°C储存两年后,荧光信号值会下降 20%。对于荧光标记引物,尤其是Cy系列及FAM荧光基团,必须采用避光包装进行储存。如果配制工作液时使用透明管,可以用锡箔将工作液管完全包裹 以避免长时间的光漂白作用。
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