数字PCR（dPCR）和实时荧光定量PCR（qPCR）是两种重要的核酸定量技术，它们的定量原理存在哪些差异呢?
qPCR是一种基于荧光信号检测来实时监测PCR反应进程的技术。其核心原理是在PCR反应体系中加入荧光标记的探针或染料，利用荧光信号的变化来反映DNA扩增的情况。
在qPCR中，常用的荧光化学物质有两种类型。一种是荧光染料，如SYBR Green I。这种染料可以非特异性地嵌入双链DNA中，当PCR反应进行，双链DNA产物增加时，染料结合到新合成的双链DNA上，荧光信号增强。由于染料可以与任何双链DNA结合，所以特异性稍差，有可能会产生非特异性扩增的荧光信号。
另一种是荧光探针，如TaqMan探针。TaqMan探针是一段寡核苷酸序列，其两端分别标记有荧光基团和淬灭基团。在游离状态下，由于荧光基团和淬灭基团靠近，荧光被淬灭。当PCR反应进行，Taq酶沿着DNA模板延伸时，其具有的5’ - 3’外切酶活性会将探针水解，使得荧光基团和淬灭基团分离，从而产生荧光信号。这种方式特异性更高，因为探针是针对特定的目标序列设计的。
qPCR的定量依据是循环阈值（Ct值）。Ct值是指在PCR扩增过程中，荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。在理想的指数扩增阶段，起始模板拷贝数与Ct值成反比。例如，起始模板拷贝数越多，荧光信号达到阈值所需的循环数就越少，Ct值也就越小。为了进行定量，通常需要先构建标准曲线。标准曲线是通过使用已知浓度的标准品进行qPCR反应，将标准品的起始拷贝数与对应的Ct值进行拟合得到的。在检测未知样本时，根据其Ct值在标准曲线上的位置来推算起始模板的拷贝数。这种定量方式是相对定量，其准确性依赖于标准曲线的准确性和实验条件的一致性。
数字PCR的定量原理
数字PCR是一种将样品进行微分区处理后再进行PCR扩增的技术，其目的是实现对核酸分子的绝对定量。
数字PCR首先要将含有目标核酸分子的样品分散成大量微小的、相互独立的反应单元，例如通过微滴式数字PCR技术，将反应体系分割成成千上万个微滴。每个微滴可以看作是一个独立的PCR反应容器。在理想情况下，每个微滴中要么包含一个目标核酸分子，要么不包含目标核酸分子。
经过PCR扩增后，对这些反应单元进行检测。含有目标核酸分子的反应单元会产生阳性信号，而没有目标核酸分子的反应单元则产生阴性信号。通过统计阳性反应单元的数量，根据泊松分布原理来计算目标核酸分子的起始拷贝数。泊松分布是一种统计学分布，用于描述在固定时间或空间内，稀有事件发生的次数。在数字PCR中，假设每个反应单元内目标核酸分子的分布符合泊松分布，通过以下公式可以计算起始拷贝数：
其中，N是起始拷贝数，p是阳性反应单元的比例，Vtotal是反应总体积，Vpartition是单个反应单元（如微滴）的体积。
数字PCR的这种定量方式不依赖于标准曲线和参照样本，是一种绝对定量方法。它可以更准确地检测低拷贝数的目标核酸，并且在检测拷贝数变异、稀有突变等方面具有独特的优势。
两者定量原理的比较
qPCR和数字PCR的定量原理主要在以下几个方面存在差异。
1、qPCR是基于荧光信号强度与PCR产物量之间的动态变化关系进行定量，其信号是连续变化的，并且依赖于在指数扩增期设定的荧光阈值来确定Ct值。而数字PCR是基于对离散的反应单元进行计数，通过统计阳性反应单元的比例来计算起始拷贝数，信号是二元的（阳性或阴性）。
2、qPCR的定量是相对定量，需要标准曲线来确定未知样本的起始拷贝数，其准确性容易受到标准曲线制作过程中的误差、样本和标准品之间的差异以及实验条件变化等因素的影响。数字PCR是绝对定量，不依赖标准曲线，能够直接给出目标核酸分子的拷贝数，在准确性上有一定的优势，尤其是对于低拷贝数样本。
3、qPCR在检测过程中可以实时监测荧光信号变化，能够在较短时间内得到结果，并且可以同时检测多个样本。数字PCR则需要先将样本进行分区处理，操作相对复杂，并且检测通量相对较低，但在检测稀有突变和低拷贝数样本时具有更高的准确性和灵敏度。
