PCR-SBT技术（Polymerase Chain Reaction - Sequence-Based Typing）是一种结合了聚合酶链反应（PCR）和序列分型（SBT）的方法，用于基因分型和鉴定。这种技术在分子生物学、遗传学、法医学以及微生物学等领域具有广泛的应用。
1. PCR扩增
PCR-SBT技术的第一步是对待测DNA进行PCR扩增。PCR，即聚合酶链反应，是一种在体外快速扩增特定DNA片段的方法。在PCR过程中，需要设计特定的引物，它们能够与待扩增的DNA片段两端互补结合。然后，在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，按照碱基互补配对的原则，合成新的DNA链。通过多次循环的变性、退火和延伸步骤，待测DNA片段得以大量扩增。
在PCR-SBT技术中，为了扩增出HLA基因的多态性区域，通常需要设计多个引物对。这些引物对能够覆盖HLA基因的所有可变位点，确保扩增出所有可能的等位基因。通过PCR扩增，可以得到大量含有不同等位基因序列的DNA片段。
2. 序列反应
PCR扩增后的DNA片段需要进行测序，以确定它们的具体序列。在PCR-SBT技术中，一般采用Sanger测序技术，也被称为双脱氧测序法。这种测序方法基于DNA合成过程中的链终止反应。在测序反应中，向PCR扩增产物中加入四种荧光标记的双脱氧核苷酸（ddNTP），它们与正常的dNTP在结构上相似，但缺少一个羟基，因此不能继续参与DNA链的合成。当DNA聚合酶在合成过程中遇到ddNTP时，链的合成就会终止。由于ddNTP的荧光标记不同，因此可以通过荧光检测器区分出不同的终止位置，从而确定DNA序列。
3. 数据分析
测序得到的数据需要进行进一步的分析和比对。首先，需要对测序数据进行整合和预处理，包括去除低质量的序列、拼接重叠的序列片段等。然后，将新测定的基因型与已知的HLA等位基因序列进行比对，以确定其种属和亚种。这一步骤需要借助专业的数据库和软件工具，如IMGT/HLA数据库等。通过比对分析，可以准确地确定待测样本的基因型别。
PCR-SBT用于HLA基因分型的技术原理图
1. 优点
(1) 高灵敏度：PCR-SBT技术可以检测到低至几个拷贝的目标基因片段，适用于微量DNA样本的检测。
(2) 高特异性：通过设计特异性引物，PCR-SBT技术可以实现对目标基因的高度特异性扩增，降低背景噪音。
(3) 高通量：PCR-SBT技术可以同时检测多个基因位点，适用于大规模基因分型和鉴定。
(4) 准确性高：通过测序分析，PCR-SBT技术可以获得目标基因的精确碱基序列，提高基因分型的准确性。
2. 缺点
(1) 操作复杂：PCR-SBT技术涉及多个步骤，操作相对复杂，需要一定的实验技能和经验。
(2) 成本较高：PCR-SBT技术所需的试剂和设备成本较高，尤其是测序费用。
(3) 耗时较长：从样本处理到最终的基因分型结果，PCR-SBT技术需要较长的时间。
1. 法医学应用
PCR-SBT技术广泛应用于法医学领域，如犯罪现场的DNA鉴定、亲子鉴定等。通过对比嫌疑人和受害者的DNA样本，可以确定嫌疑人的身份和作案动机。此外，PCR-SBT技术还可以用于古代人类遗骸的基因分析，揭示人类起源和迁徙历史。
2. 遗传病诊断
PCR-SBT技术可用于遗传病的诊断和筛查。通过对患者基因组中的致病基因进行分型，可以确定疾病的遗传模式和风险。此外，PCR-SBT技术还可以用于携带者筛查和产前诊断，为家庭提供生育建议。
3. 微生物鉴定
PCR-SBT技术可用于细菌、病毒、真菌等微生物的鉴定和分型。通过对微生物基因组中的特定基因进行分型，可以确定微生物的种类和亚种，为临床诊断和治疗提供依据。此外，PCR-SBT技术还可以用于监测微生物的耐药性和传播途径。
4. 生态学研究
PCR-SBT技术可用于生态系统中生物多样性的研究。通过对不同物种的基因组进行分型，可以评估物种间的亲缘关系和进化历史。此外，PCR-SBT技术还可以用于监测环境污染对生物多样性的影响，为生态保护提供科学依据。
