分子信标（Molecular beacons），也叫分子灯塔，这一技术是由纽约市公共健康研究协会的Tyagi和Krammer于1996年首次建立的，分子信标技术基于荧光共振能量转移（FRET）现象和碱基互补配对原则，具有极高的特异性和灵敏度，而且操作简便，可以进行实时定量检测，甚至用于活体分析。如今，分子信标技术已经广泛的应用在基础医学研究中的众多领域。
分子信标探针由以下几个关键部分组成：
环状区：该区域包含与靶DNA互补的碱基序列，是分子信标的识别部分，能与靶基因自发地进行杂交。环部应为15~33 bp，且环序列必须与靶DNA序列互补，该部分Tm值应该比PCR的退火温度高7~10℃。
茎部：是一段4~12对碱基互补的发夹结构，用于维持探针的稳定性。茎部的设计应避免与环部序列之间互补，以及避免与引物序列之间互补。
荧光基团：通常连接在探针的5′端，常用的荧光基团有TexasRed、FAM等。当荧光基团与淬灭基团分离时，会发出荧光信号。
淬灭基团：连接在探针的3′端，常用的淬灭基团有4-（4’-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）。在荧光基团与淬灭基团距离较近时，淬灭基团会吸收荧光基团发出的荧光，并以热的形式散发，从而不会检测到荧光信号。
分子信标探针的工作原理基于荧光共振能量转移（FRET）原理。在自由状态下，分子信标呈发夹结构，荧光基团与淬灭基团距离很近，通常小于10nm，此时荧光被淬灭。当分子信标探针与靶序列结合时，探针的发夹结构打开，荧光基团与淬灭基团分离，距离变远，荧光基团发出的荧光不能被淬灭基团吸收，于是可检测到荧光信号。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光基团与淬灭基团之间达到一定的距离时才会产生荧光。
分子信标工作原理图
序列设计
其环部序列要与靶标序列完全互补，这会直接影响杂交的特异性和效率。如果互补性差，就难以和目标分子有效结合。
茎部的长度和碱基组成会影响分子信标的稳定性。一般茎部长度适中，过短会使信标在未结合靶标时就容易打开，产生荧光信号；过长则可能会影响与靶标结合的动力学过程。
温度
温度过高，分子信标的茎部双链结构易解开，出现假阳性信号；温度过低，靶标与分子信标杂交的动力学过程会变慢。
Bonnet等研究温度对分子信标影响时发现，体系的荧光强度呈现为一个先减弱后增强的过程。就此，Bonnet等做出如下解释：
在较低温度下，分子信标与靶标结合呈S1状态，发出荧光。随着温度升高，分子信标与靶标分离，分子信标重新恢复为发卡式结构即S2状态，从而荧光强度减弱。温度持续增高，将导致分子信标熔链即S3状态，荧光基团与淬灭基团分离，导致荧光恢复。 |
离子强度
溶液中的离子强度会影响分子信标的稳定性。合适的离子强度有助于维持分子信标的结构和功能。如在一定范围内增加离子强度，可以增强核酸分子之间的相互作用，稳定分子信标的茎部结构。
pH值
极端的pH值会破坏分子信标核酸的结构。因为核酸的磷酸二酯键和碱基对在过酸或过碱条件下可能会被水解或者质子化，影响其正常的杂交等功能。
荧光基团和猝灭基团
荧光基团的量子产率决定了产生荧光信号的效率。量子产率越高，产生的荧光信号越强。
猝灭基团的猝灭效率会影响荧光背景信号。高效的猝灭基团可以使分子信标在未结合靶标时保持较低的荧光背景。荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。
特异性强
分子信标探针的环部序列与目标核酸互补，茎部的存在使得探针在未结合目标序列时保持特定的发夹结构，这种结构使得它能够精准地识别目标核酸序列，减少非特异性结合，能有效区分单碱基差异的序列，在检测基因点突变等方面非常有优势。
灵敏度高
分子信标探针可以检测到低至1拷贝的核酸，具有很高的灵敏度。
实时监测
可以用于实时定量PCR等实验过程。在反应过程中，随着目标核酸序列的增加，分子信标探针与目标序列结合，荧光信号发生变化，通过检测荧光信号就能实时监测反应进程，比如可以动态观察病原体核酸在体内的复制情况。
设计复杂
需要精心设计探针的序列，包括茎部和环部的长度、碱基组成等。要考虑茎部的稳定性，以确保在没有目标核酸时能保持发夹结构，环部又要能很好地与目标核酸互补结合，这对设计人员的专业知识和经验要求较高。
易受环境影响
分子信标探针的荧光信号可能会受到温度、pH值、离子强度等环境因素的干扰。例如，不合适的pH值可能会破坏探针的结构，从而影响荧光信号的产生和检测。
成本较高
无论是探针的合成，还是对检测仪器的要求（需要能精确检测荧光信号变化的仪器），都使得使用分子信标探针进行检测的成本相对较高，限制了它在一些资源有限的环境中的大规模应用。
分子信标探针在多个领域具有广泛的应用：
基因工程：可用于对PCR产物进行实时定量、定性分析，特别适用于基因的点突变、SNP检测、等位基因分析等。
生物医学研究：可用于研究DNA与蛋白质的作用及DNA损伤试剂的相互作用，具有简单、灵敏、通用的特点。
传感器与芯片技术：可用于DNA传感器和DNA芯片的研究，通过固定不同荧光基团的分子信标探针到硅片表面，制成分子信标芯片。
近年来，人们对分子信标的结构作了诸多改进，发展出很多具有更多特性的新型分子信标。随着分子信标的发展，该技术也必将在更多领域中发挥出它的优势。
【参考文献】
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