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背景：DNA甲基化模式的改变是理解与人类衰老相关表型变化的一个有吸引力的机制。多项研究描述了与年龄相关的整体性和复杂的甲基化变化，但其结构和功能意义仍然不清楚。
结果：我们利用转录组测序表征了人类表皮中与年龄相关的基因表达变化。结果揭示了75个具有显著功能关系的差异表达基因，这些基因与皮肤稳态密切相关。然后，我们使用全基因组重亚硫酸盐测序，在单碱基分辨率水平上识别了与年龄相关的甲基化变化。数据分析显示，没有出现全局性的变化，而是高度局部化的甲基化改变，特别是在与转录活性变化相关的启动子和增强子区域。结论：我们的研究结果表明，人类皮肤的核心发育程序在衰老过程中保持稳定，而衰老与基因调控元件上表观基因组的有限去稳定化相关。关键词：衰老、DNA甲基化、表皮、甲基化组测序、转录组测序表观遗传机制可以解释基因信息的调控过程，它还与细胞分化和组织特异性密切相关。表观遗传机制包括DNA甲基化和组蛋白修饰（Klose RJ和Bird AP, 2005；Kouzarides T，2007）。这些机制在发育和分化过程中协调工作，以执行特定的基因表达程序（Xie W等人, 2013；Gifford CA等人，2013）。DNA甲基化是一种保守的表观遗传机制，在细胞命运决定中具有重要作用（Mohn F和Schubeler D, 2009；Bergman Y和Cedar H，2013）。在小鼠中，这一功能对于个体发育至关重要，因为DNA甲基转移酶的基因缺陷会导致严重的发育表型和胚胎致死（Li E等人, 1992；Okano M等人，1999）。最近，DNA甲基化的适应性功能也引起了极大关注，这可能为环境信号的整合提供基础（Feinberg AP, 2007）。最初观察到的单卵双生子之间的表观遗传差异（Fraga MF等人, 2005），现已在多项独立研究和组织中描述了与年龄相关的甲基化差异（Winnefeld M和Lyko F, 2012）。结果表明，衰老会引起人类甲基化环境的全局性和复杂变化（Christensen BC等人, 2009；Rakyan VK等人，2010；Teschendorff AE等人, 2010；Heyn H等人，2012）。然而，目前尚不清楚这些表观遗传变化如何影响衰老人类组织的基因表达模式。我们之前曾使用基于阵列的甲基化分析对从年轻和老年志愿者获得的皮肤样本进行甲基化分析，确定了一组在老化皮肤中高甲基化的基因（Gronniger E等人, 2010）。在这项研究过程中，确定了两个重要特征，将表皮确立为进一步分析的重要组织：i）表皮样本可以通过非侵入性程序获取，并且具有非常高的细胞类型同质性（>90%角质形成细胞），这极大促进了确定的甲基化模式的识别；ii）表皮是对人类健康和疾病具有高度功能相关性的组织，并且显示出众所周知的老化表型（Zouboulis CC和Makrantonaki E, 2010）。此外，研究还表明，DNMT1 DNA甲基转移酶在功能上是人表皮中正常组织稳态所必需的酶（Sen GL等人, 2010）。衰老是一个多因素过程，会导致再生能力和组织功能的逐步丧失。此前有人提出，这些病理变化是由全基因组甲基化标记的缺失所支撑（Heyn H等人，2012）。我们现在使用转录组测序来识别在年轻（18-24岁）和老年（70-75岁）人类表皮中差异表达的基因。这揭示了一组具有高度特异性的75个基因，这些基因对人类皮肤稳态具有强大的功能相关性。我们还使用全基因组亚硫酸氢盐测序从相同的组织样本中生成甲基化图谱。我们发现，老化表皮的甲基组具有良好的稳定性，没有显示出任何全局甲基化丧失。然而，可以观察到局部的与年龄相关的甲基化变化，并在弱启动子或准备启动子以及增强子区域富集，这表明表观遗传机制与皮肤老化的功能相关性。我们从五名女性供体的前臂内侧皮肤获得了原代人类表皮样本，这些供体分别来自两个不同的年龄组（18-24岁和70-75岁，详情见附加文件1：表S1）。这两个年龄组很好地代表了健康成年人的皮肤衰老表型（Zouboulis CC和Makrantonaki E, 2010）。RNA纯化后，将样本以等摩尔比混合，以便为转录组测序准备文库。样本的混合是为了获得足够量的mRNA以用于文库制备。在Illumina HiSeq 2000平台上进行双端测序，读取长度为105个碱基，可生成90 Gb的DNA序列。将读取长度修剪至最大80个碱基和最低碱基质量为30 Phred分数后，使用TopHat将序列读数映射到GRCh37/hg19参考序列（Trapnell C, 2009）。最终，每个样本的平均链特异性基因组覆盖率为500倍（表1）。覆盖率表示平均链特异性基因组或转录组覆盖率。亚硫酸氢盐转化率是通过分析被认为是未甲基化的共纯化线粒体基因组的转化率来确定的。线粒体基因组覆盖率分别为 1319x（年轻）和 1643x（老年）。N.D.：未确定。总体而言，表皮转录组的特征是表皮特异性基因的高表达水平，例如各种表皮角蛋白以及表皮结构基因Loricin和Filaggrin（表2）。主要在间充质来源细胞中表达的基因，如波形蛋白和结蛋白，未能检测到或仅有低水平表达（表2），这与本研究所用样本的大量细胞类型均一性一致。这些基因的表达模式在年轻表皮和老年表皮中表现出高度相似性（表2），反映了分化人体组织核心表观遗传程序的稳定性。与此观点一致，DNA甲基化酶（如DNMTs和TETs及其已知的辅助因子DNMT3L和UHRF1）的基因表达水平在老年样本和年轻样本中均较低且非常相似（表2）。表达式水平表示FPKM值(Trapnell C等人，2012);级别 >1 表示表达;q值通过DESeq (Anders S和Huber W，2012)计算。为了系统地识别在年轻样本和老年样本中差异表达的基因，我们使用了DESeq (Anders S和Huber W，2012)。结果揭示了75个具有统计显著差异的基因（Q <0.05，见附加文件2：表S2），这表明年轻表皮和老年表皮的转录组总体上相似。年龄相关差异基因表达的效应量相对较小也证实了这种相似性（图1A）。我们还使用了独立的差异表达分析算法Cuffdiff 2 (Trapnell C等人，2012)，其识别的差异表达基因总数为107个。值得注意的是，在DESeq识别的75个基因中，有68个也被Cuffdiff 2识别到（图1B）。这一显著的重叠表明，人类表皮的衰老影响了一组特定基因的表达。图1.人类表皮衰老的转录组.（A）MA 图显示年轻人和老年人之间的倍数变化与平均表达水平的关系。红色标记表示通过 DESeq 分析确定的具有显着差异表达的基因。（B） 维恩图显示了差异表达基因集的重叠，由 DESeq（绿色）和 Cuffdiff 2（橙色）确定。（C） 结缔组织生长因子 （CTGF） 作为差异表达基因的代表性示例。RNA-seq覆盖率适用于年轻（蓝色）和老年（红色）样品。（D）差异表达基因的独创性通路分析。该图显示了四个最显著丰富的功能类别。进一步分析差异基因表达，发现了一些之前暗示与皮肤稳态相关的因素。例如，结缔组织生长因子（CTGF）已被证明是皮肤衰老中的重要因素(Quan T等人，2010)，在老年表皮中的表达水平明显降低（图1C）。我们还使用差异表达基因的路径分析，进一步表征了与年龄相关差异基因表达的功能效应。结果显示，涉及细胞迁移（P = 1.17 × 10^-16）、癌症（P = 9.55 × 10^-13）、皮肤病（P = 2.07 × 10^-11）和细胞增殖（P = 1.4 × 10^-10）的基因类别具有最显著的富集（图1D）。此外，差异基因表达的功能注释也显示参与表皮发育的基因富集非常显著（P = 9.63 × 10-4），其中还包括老年样本中SPRR1A和B、KRT16和KRT17的下调。与这一发现一致，涉及角质形成细胞分化的基因在老年样本中的表达也发生了变化，表明总体上分化的下调（P = 1.43 × 10^-7）。综上所述，我们的研究结果表明，一组相对较小的基因失调可能导致与人类皮肤衰老相关的表型变化。为了进一步分析差异基因表达的模式，我们实验验证了来自两个年龄组（9 名年轻和 9 名老年）的 18 个个体表皮样本中特定基因的差异表达水平。在这些实验中，我们选择了 15 个具有与皮肤稳态相关的功能注释的基因，这些基因在我们的 RNA-seq 分析中显示出不同程度的年龄相关下调。结果显示，在RNA-seq分析中表达变化≥2倍的9个基因中，有8个基因表现出显著的差异基因表达（P < 0.05，Mann-Whitney U检验）（图2）。对于表达变化<2倍的基因，仅在6个基因中的2个基因观察到显著的差异表达（图2）。这些发现为我们的转录组测序结果提供了重要的证实，并表明与年龄相关的基因失调在很大程度上具有群体一致性。图2.单个组织样本中不同年龄相关基因表达的验证。对 18 名健康女性志愿者（9 名年轻志愿者和 9 名老年志愿者）的表皮抽吸水泡的 RNA 进行 qRT-PCR。热图显示处理过的 ΔCt 值。单个样品的基因表达差异相对于所有样品的基因特异性、与年龄无关的平均表达水平表示（蓝色：较低的 ΔCt，红色：较高的 ΔCt）。左列中的数字表示年轻人和老年人之间基因表达的倍数变化差异，由转录组测序确定。P 值通过 Mann-Whitney U 检验确定，表明差异基因表达的显着性。VCL 和 RHPN2 之间的界线将基因表达变化为 ≥2 倍的基因与基因表达变化为 <2 倍的基因区分开来.在验证了衰老与一组高度特定的基因调控失衡相关之后，我们利用全基因组亚硫酸盐测序技术，确立了单碱基分辨率的DNA甲基化图谱。我们从用于转录组测序的同一表皮样本中提取了DNA（附加文件1：表S1）。为了获得足够的DNA量以进行文库制备，并且为了减少随机表观遗传变异的影响，样本的合并是必要的，这在之前的研究中已被采用(Raddatz G等人，2012)。在Illumina HiSeq 2000平台上进行测序，读取长度为105个碱基，产生了137Gb的DNA序列。在修剪到最大读长为 80个碱基和最小碱基质量为 30 Phred 分数后，使用基于 BSMAP 2.0 的映射工具将序列读数映射到 GRCh37/hg19 参考序列。由此得出，年轻样本的平均链特异性基因组覆盖率为11.3倍，老年样本为11.9倍。我们还通过分析在样本制备过程中共同纯化的线粒体序列来确定亚硫酸氢盐转化率，我们认为这些序列是未甲基化的。这些序列显示出亚硫酸氢盐转化率超过99.8%（表1），表明亚硫酸盐处理极为有效。初步数据分析显示，人类表皮与已发表的分化培养人类细胞系的表观基因组具有许多基本特征(Xie W等人，2013；Gifford CA等人，2013；Lister R等人，2009；Hon GC等人，2012)。例如，发现绝大多数（>99.9%）非转化胞嘧啶处于CpG二核苷酸环境中（图3A），这与整体的脱氨效率一致，并符合非CpG甲基化主要限于胚胎干细胞的观点（Lister R等人，2009）。此外，单个CpG二核苷酸的甲基化比率揭示了特征性的双峰分布（图3B）。CpG二核苷酸的大部分（约50%）显示出完全甲基化，甲基化比率为超过0.95（图3B）。大约 10% 的 CpG 完全未甲基化（甲基化比 <0.05），而40%的CpG二核苷酸显示出0.05至0.95之间的部分甲基化比例（图3B）。CpG位点的平均甲基化比例为0.74（图3C），这与在其他人类数据集中观察到的CpG甲基化比率再次一致。此外，与基因组平均水平相比，与启动子相关的CpG位点的平均甲基化比例明显较低，而基因体和基因间区域显示出更高的甲基化水平（图3C），这与已发表的其他数据集相似。图3：衰老人体表皮的甲基化组。（A） 未转化胞嘧啶残基的二核苷酸环境。（B） 确定所有覆盖CpG二核苷酸平均甲基化水平，然后将其分配到以递增的甲基化比例为界的区间内。百分比表示未甲基化（浅橙色）、部分甲基化（橙色）和完全甲基化（深橙色）CpGs的比例。（C）显示了年轻（蓝色）和老年样本（红色）的基因组（全部）、启动子、基因体和基因间区域的平均DNA甲基化比例。（D） 8 号染色体的甲基化模式，显示在 100 kb 窗口的轨迹中。蓝线表示年轻样本，红线表示老年样本。（E） 覆盖整个基因组的 100 kb 窗口的平均甲基化比例密度图。数字表示甲基化差异为 >0.15（虚线）的窗口数。（F） 覆盖 4 号染色体的 5-CpG 窗口的平均 DNA 比例密度图。总体而言，年轻和老年样本的甲基化模式看起来非常相似。这不仅体现在单个基因组区段的平均甲基化比例上（图3C），而且体现在全局甲基化情况的比较中（图3D）。滑动窗口方法仅识别出 50 个 100 kb 的差异甲基化窗口（甲基化差异 >0.15），具有相同数量的低甲基化和高甲基化窗口（图 3E）。同样，使用5个CpG位点的滑动窗口进行更局部的分析，并未揭示全局甲基化模式的任何方向性变化（图3F）。总之，这些发现共同充分表明，在T细胞中观察到的与年龄相关的整体甲基化丢失（Heyn H 等人，2012），在表皮中并不保守。对年轻和老年甲基化图谱进行直观检查，也表明存在小簇的差异甲基化 CpG 二核苷酸。为了系统地识别差异甲基化区域 （DMRs），采用了Fisher精确检验来确定具有统计学显著性（P < 0.05）的甲基化差异的CpG二核苷酸。这些差异甲基化的 CpG位点（DMCs） 随后被折叠，以识别局部协调的甲基化变化区域。DMRs被定义为至少包含8个DMCs的簇，相邻DMCs之间的距离不超过50个碱基对，并且整个区域的净甲基化变化至少为8个DMCs。只有平均测序覆盖度达到或超过8倍，且甲基化差异达到或超过10%的DMRs才被用于进一步分析。通过这种方法，共鉴定出2409个DMRs，其中1437个在老年样本中的甲基化程度更为显著，而972个在年轻样本中的甲基化程度更为显著。DMRs相对较小（小于150个碱基对），并且与不同的基因区域相关联。值得注意的是，这些DMRs中有1156个与最近通过全面分析的42个人类甲基化组鉴定的可变甲基化区域重叠（Ziller MJ ，2013）。这代表了相对于基因组平均水平的2.5倍富集，暗示与年龄相关的甲基化变化影响着表观遗传调控元件。为了进一步表征差异性甲基化区域（DMRs），我们利用了正常人类表皮角质形成细胞的现有ENCODE数据（Ernst J和Kellis M，2010；Ernst J和Kellis M，2012）。结果显示，老年样本中高甲基化的DMRs富集了H3K27me3和H3K4me3，这些是处于待激活状态启动子的标志性染色质标记。相比之下，在老年样品中低甲基化的低甲基化DMRs富集了H3K27Ac和H3K4me1（图4A），它们代表了增强子的既定标记。然后，我们使用正常人表皮角质形成细胞的可用ChromHMM注释（Consortium EP ，2011），将我们的DMRs数据集分配给已定义的染色质状态（附加文件3：表S3）。随后的数据分析显示，DMRs在启动子和增强子中显著富集（图4B），这证实并扩展了之前对年龄相关甲基化变化的观察结果（Rakyan VK ，2010；Teschendorff AE ，2010）。此外，增强子相关的DMRs显示出对年龄相关低甲基化的强烈倾向（图4B），这可能反映了与年龄相关的增强子激活。有趣的是，活性启动子并未显示出对DMRs的富集（图4B），这与年龄相关的差异基因表达相对较小的效应大小（图1A）是一致的。![]()
图4.差异性甲基化区域（DMRs）的表征。(A) 高甲基化和低甲基化的DMRs表现出不同的染色质状态。在老年表皮中变得高甲基化的DMRs（hyperDMRs）富集了H3K4me3和H3K27me3，而在老年表皮中变得低甲基化的DMRs（hypoDMRs）富集了H3K27ac。x轴下方的数字表示距离DMR中心（虚线垂直线）的距离，单位为碱基对。(B) 在定义的基因组段内DMRs的富集。条形图表示观察到的DMR频率与基因组中平均频率的比率。蓝色条形代表老年表皮中低甲基化的DMRs，红色条形代表老年表皮中高甲基化的DMRs。(C) ERBB受体反馈抑制因子1（ERRFI1）的启动子区域含有一个代表性的DMR。ERRFI1对于维持正常的表皮稳态（Ferby I，2006）是必需的，并且在老年表皮样本中的表达水平较低（右侧面板，蓝色和红色条形分别表示年轻和老年表皮样本中的表达）。蓝线表示年轻表皮中的甲基化比例，红线表示老年表皮中的甲基化比例。绿色条形指示ERRFI1启动子CpG岛的位置。(D) 低密度脂蛋白受体（LDLR）基因区域的一个注释的活性增强子元件含有一个DMR。与老年样本中LDLR表达水平降低相关的年龄相关甲基化变化（右侧面板，蓝色和红色条形分别表示年轻和老年表皮样本中的表达），这可能促进了黄斑病的形成，黄斑病是一种在老年人群中常见的皮肤病变。直观检查差异性甲基化区域（DMRs）为我们提供了关于其特性的深入理解。例如，表皮生长因子受体反馈抑制因子1（ERRFI1）的启动子区域，在与启动子相关的CpG岛区域携带有DMR（图4C）。ERRFI1对于维持正常的表皮稳态至关重要（Ferby I ，2006），在老年表皮样本中发现其呈现高甲基化状态，并在表达水平上有所降低（图4C）。另一个DMR的例子在低密度脂蛋白受体（LDLR）基因区域被识别出来（图4D），并且位于已注释的活性增强子元件中（附加文件4：图S1）。该DMR显示了复杂但协调的年龄相关甲基化变化，这与老年样本中LDLR的较低表达水平有关（图4D）。LDLR基因缺陷是家族性高胆固醇血症的原因，而家族性高胆固醇血症是黄斑病形成的基础（Ishibashi S ，1994），黄斑病是一种常见于老年人群的皮肤病变。这些例子说明了与年龄相关的甲基化变化如何对维持正常皮肤稳态至关重要的基因产生相对微妙但显著的表达变化。需要进一步的实验来确定个体差异甲基化和表达基因与衰老表型的功能相关性。全基因组亚硫酸氢盐测序是一种有效的方法，能够在单碱基分辨率下生成全基因组的甲基化图谱（Lister R等人 ，2009；Lister R 等人，2008）。这种方法最近被用来表征新生儿和百岁老人纯净CD4+ T细胞的甲基化组（Heyn H 等人，2012）。结果显示，衰老的表观遗传组出现了明显的不稳定，其特征是广泛丧失甲基化标记。我们的分析未能检测到年轻和老年个体在全局甲基化水平上的任何定量差异。这最有可能归因于两项研究中使用的组织不同：我们分析基于原代表皮样本，而Heyn等人（Heyn H 等人，2012）使用了纯净的CD4+ T细胞。基于T细胞分化和激活的特定特征，可以想象这些细胞的表观遗传程序具有特别高程度的可塑性。在全局层面上，年轻与老年表皮的转录组和甲基化组表现出显著的相似性。这是一个重要的发现，因为它展示了组织特异性甲基化环境的基本稳定性，这对于稳定维持细胞类型是必需的。与年龄相关的甲基化变化仅限于特定的局部改变，这证实并扩展了我们之前的观察结果（Gronniger E等人，2010）。与年龄相关的差异性甲基化区域的大小为100-150碱基对，比人类甲基化组的其他已知结构要小得多，例如DNA甲基化谷（Xie W 等人，2013）和部分甲基化结构域（Raddatz G等人 ，2012；Lister R 等人，2019；Hon GC 等人，20112；Lister R 等人，2011；Berman BP等人 ，2012），它们分别延伸到数十和数百千碱基的DNA序列上。为了深入理解这些元素的表观遗传调控作用，未来将需要进行更深入的分析。有趣的是，我们的研究数据还表明，很大一部分的差异性甲基化区域（DMRs）可能在衰老过程中异常甲基化，表现为增强子。最近报道了增强子相关CpG二核苷酸的甲基化状态与人类癌症中表观遗传基因失调密切相关（Aran D 等人，2013；Aran D和Hellman A，2013）。我们的数据在单碱基分辨率上识别了这些元素，并表明增强子的差异性甲基化可能与年龄相关的基因失调有关。最后，我们的分析确定了启动子区域中高甲基化DMRs的例子。启动子高甲基化与基因沉默密切相关，并在人类肿瘤的病因学中起着重要作用（Esteller M ，2008；Baylin SB和Jones PA，2011）。此外，我们的数据表明高甲基化DMRs与双价染色质结构有关。在研究其他组织中与年龄相关的甲基化变化的独立研究中，也描述了类似的结果（Rakyan VK 等人，2010；Teschendorff AE 等人，2010）。双价染色质修饰是干细胞的一个特定特征，通常不存在于表皮等分化组织中。因此，与年龄相关的高甲基化在被注释为“双价”的启动子中的特别富集，可能反映了衰老表皮干细胞的表观遗传变化，并可能是衰老干细胞再生能力下降的基础（Sharpless NE和DePinho RA，2007）。各种研究已经描述了与年龄相关的DNA甲基化变化，但其定义特征和功能意义仍有待确定。我们的研究结果表明，在T细胞中观察到的与年龄相关的全基因组DNA甲基化损失（Heyn H 等人，2012）在人类表皮中并不保守，这表明至少一些人类组织的核心发育程序在衰老过程中得以维持。此外，我们的研究首次使用转录组测序来探索与年龄相关的表观遗传变化的结果。我们的结果确定了有限的转录变化，这些变化可能是构成衰老表型的基础。最后，我们发现了数百个高度局部化的区域，它们在年轻和老年之间显示出显著的甲基化差异。有趣的是，这些元素富集于基因调控的染色质标记，其中许多与启动子和增强子相关。因此，我们的研究为理解与年龄相关的表观遗传调控失衡提供了一个重要的机制框架。表皮吸疱样本的收集遵循《赫尔辛基宣言》的最新版本，并根据国际协调会议良好临床实践（ICH GCP）的指南，适用于非药物研究。所有志愿者都提供了书面知情同意。在Beiersdorf AG的研究中心，通过施加150-250毫米汞柱的负压2小时，从10名健康女性志愿者的前臂上分离出表皮样本，并得到了Beiersdorf AG法律审查委员会的批准。简而言之，吸疱样本的表皮被取下，并立即存储在液氮中。为了核酸的分离，吸疱样本在DPBS（比利时Verviers的Cambrex公司）中洗涤，并使用TissueLyser（德国Haan的Retsch公司）进行匀浆。使用QIAamp DNA Investigator Kit（德国Hilden的Qiagen公司）和RNeasy Fibrous Tissue Kit（Qiagen）分别按照制造商的说明从吸疱样本中分离DNA和RNA。mRNA的选择使用了Poly(A)Purist MAG Kit（德国Darmstadt的Ambion公司）。亚硫酸盐测序的文库制备按照先前描述的方法（Lyko F 等人，2010）进行。转录组测序文库的制备采用TruSeq RNA样本制备试剂盒（Illumina公司，美国圣地亚哥），并根据制造商的指南进行操作。在Illumina HiSeq系统上执行了成对末端测序，读取长度为105碱基对，平均插入片段大小为200碱基对。RNA测序读取在达到最大长度80个碱基对时被截断，并且在读取的两端，质量评分小于30的碱基序列被去除。使用Tophat 2.0.6（Trapnell C 等人，2009）进行读取的映射。作为转录组图谱绘制的参考序列，我们采用了当前版本的人类基因组组装（hg19）。差异表达量是通过DESeq 1.10.1（Anders S和Huber W ，2012）进行量化的，应用内置的文库标准化程序和方差估计，以及Cuffdiff 2.0（Trapnell C 等人，2012）。得到的P值分别通过DESeq和Cuffdiff内置的多重检验校正功能进行了校正。q值小于0.05的基因被认为是差异性表达的。差异表达基因的通路分析是利用IPA（Ingenuity Systems）进行的，使用了差异表达的P值截止点<0.05和至少0.263的对数倍数变化，这对应于年轻样本与老年样本之间至少30%的最小表达量变化。采用Qiagen公司的RNeasy Fibrous Tissue Kit（德国）根据制造商的指导从吸疱样本（n = 18）中提取总RNA。使用Applied Biosystems（德国达姆施塔特）的High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit进行逆转录后，样本通过7900HT Fast-Real-Time PCR System（Applied Biosystems）进行TaqMan-PCR分析。根据制造商的建议，使用了以下检测试剂：CTGF（Hs01026927_g1）、SPRR1A（Hs00954595_s1）、SPRR1B（Hs00234164_m1）、KRT16（Hs00373910_g1）、KRT17（Hs01588578_m1）、VCL（Hs00247826_m1）、HAS3（Hs00193436_m1）、FDZ10（Hs00273077_s1）、NPR3（Hs00168558_m1）、VPS37B（Hs00226582_m1）、ERRFI1（Hs00219060_m1）、PLIN2（Hs00605340_m1）、RHPN2（Hs00369111_m1）、RGMA（Hs00297192_m1）、PI4KB（Hs01090927_m1）。数据通过7900 Sequence Detector附带的Sequence Detector version 2.3软件和RQ Manager 1.2进行分析。使用ΔCt方法进行定量，该方法表示目标基因相对于内参（GAPDH；Hs99999905_m1）的表达。对每个基因/受试者组合的所有重复的ΔCt值取平均值，然后对每个基因的所有受试者的平均值进行减法操作，从而将平均基因特异性ΔCt值调整为零。处理后的ΔCt值以热图形式呈现。超过阈值2.5的ΔCt值被设为2.5。读取序列被截断至最大长度80个碱基对，并且在读取序列两端质量评分小于30的碱基序列被去除。使用BSMAP 2.02（Xi Y和Li W，2009）进行读取序列的映射。作为亚硫酸盐图谱绘制的参考序列，我们采用了当前版本的人类基因组组装（hg19）。只有正确距离内读取对的两个配对同时映射的读取被采用。通过计算所有映射读取中所有非CpG位置上被判定为胞嘧啶的数量，除以所有映射读取中所有非CpG位置上的碱基数，从而得出CpG特异性。甲基化比例是使用随BSMAP软件包分发的Python脚本（methratio.py）确定的。对于正向和反向链，所有处于CG背景中的胞嘧啶碱基被独立地判定。采用Fisher精确检验来识别在年轻和老年数据集中甲基化比例具有统计学显著差异（P <0.05）的3,004,806个CpG二核苷酸。随后将差异性甲基化的CpG位点（DMCs）合并，以识别局部协调的甲基化变化区域。DMRs被定义为至少包含8个DMCs的簇，相邻DMCs之间的距离不超过50个碱基对，并且整个区域的净甲基化变化至少为8个DMCs。只有平均测序覆盖度达到或超过8倍，且甲基化差异达到或超过10%的DMRs才被用于进一步分析。从ENCODE网站（Consortium EP ，2011）下载了NHEK细胞中组蛋白修饰标记的ChIP-seq峰值，并在DMR位点周围的50个碱基对窗口中进行了平均化处理。应用了10%跨度的Loess平滑处理。为了在定义的染色质状态下进行DMRs的富集分析，将中心位于给定状态（NHEK细胞中的ChromHMM注释数据，ENCODE网站）的DMRs的观察频率（%）除以该状态的基因组频率。测序数据已经存放在GEO数据库中，存取编号为GSE46487。https://doi.org/10.1186/1756-8935-6-36随着全球化妆品行业规模持续扩大，市场竞争日趋激烈，原料转化与应用、产品创新、技术更新等成为破局关键，随着生物制造技术的进步，生物活性原料与绿色可持续原料的创新开发备受瞩目，同时基于新技术也为行业注入了新的活力。InnoCosme第九届中国国际护肤技术论坛，旨在汇聚行业精英，深入探讨原料转化与应用、再生医学、皮肤微生态、递送技术、消费者洞察趋势等业内关注的热点话题，并结合抗衰、维稳修护等功效，共探产品革新路径，旨在为行业带来新的启示与机遇，共同开创行业发展的新篇章！
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