科研干货 | 琼脂糖凝胶电泳的原理——分子筛效应

文摘   2024-11-24 09:01   湖南  

琼脂糖凝胶电泳的原理中的分子筛效应是指凝胶基质中存在的不同大小的孔隙对通过的分子产生的选择性阻滞作用。琼脂糖凝胶由琼脂糖分子通过氢键形成的多孔网络结构,其孔隙大小取决于琼脂糖的浓度和类型。一般来说,琼脂糖浓度越高,孔隙越小,分子筛效应越强。
在电泳过程中,不同大小的核酸分子在通过琼脂糖凝胶时,受到的阻力不同。大分子由于受到较大的阻力,迁移速度慢;而小分子受到的阻力小,迁移速度快。因此,核酸分子的迁移距离与其分子量呈反比关系,实现了基于大小的分离。这种分子筛效应使得琼脂糖凝胶电泳能够根据核酸分子的大小进行有效分离。

此外,琼脂糖凝胶电泳的分析原理与其他支持物电泳的主要区别在于它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构,物质分子通过时会受到阻力,大分子物质在涌动时受到的阻力大,因此在凝胶电泳中,带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量,而且还取决于分子大小,这就大大提高了分辨能力。由于其孔径相比于蛋白质太大,对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道,现广泛应用于核酸的研究中。

一、琼脂糖凝胶的特性

琼脂糖凝胶是一种天然线性聚合物,来源于红藻,由D-和L-半乳糖残基交替连接形成长链。在加热溶解后冷却,琼脂糖能形成半固体的凝胶状态。这种凝胶具有多孔性,孔径大小与DNA分子的直径相当,使其成为分离介质的理想选择。此外,琼脂糖凝胶具有亲水性且几乎无带电基团,因此对生物大分子极少引起变性和吸附,是一种惰性载体,适用于各种生物分离和分析的应用场景。

琼脂糖凝胶是一种常用的电泳介质,具有以下特性:
  • 透明度好:琼脂糖凝胶溶解快,胶液清澈透明,有利于观察和分析。

  • 高强度:琼脂糖凝胶具有较高的强度和弹性,即使是低浓度的凝胶也不易破碎,保证了实验的稳定性。

  • 低电内渗:琼脂糖凝胶的电内渗(EEO)较低,减少了对电泳质点迁移与分离的影响,这对于精确的电泳分析非常重要。

  • 极低的背景:琼脂糖凝胶没有其他荧光物质干扰,泳带与背景黑白分明,拍摄的图片效果好,便于结果的观察和记录。

  • 无核酸酶和蛋白酶:琼脂糖凝胶不含有核酸酶和蛋白酶,因此不会对DNA或蛋白质造成降解,是理想的惰性载体,适合用于生物大分子的分离。

  • 凝胶制备简单:琼脂糖在水中加热到90℃以上溶解,温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶,这是它具有多种用途的主要特征和基础。

  • 凝胶性能:琼脂糖凝胶性能通常用凝胶强度表示,强度越高,凝胶性能越好。质量较好的琼脂糖强度通常在1200克/cm²以上(1%胶浓度)。

  • 亲水性:琼脂糖具有亲水性,并几乎完全不存在带电基团,对敏感的生物大分子极少引起变性和吸附。

  • 孔隙结构:琼脂糖凝胶的孔隙大小可以通过调整琼脂糖的浓度和制备条件来控制,这对于DNA或RNA片段的分离至关重要。

这些特性使得琼脂糖凝胶成为分子生物学实验中不可或缺的工具,尤其是在核酸的分离和分析中。
二、电泳原理
电泳是一种分子分离技术,其原理涉及两个主要效应:电荷效应和分子筛效应。首先是电荷效应,当DNA分子处于碱性条件下时,会带有负电荷。在电场作用下,DNA分子会受到电场力,导致向正极方向移动。由于迁移速率与DNA的电荷量和长度成正比,较长的DNA片段会迁移较慢,而较短的DNA片段会迁移较快。
其次是分子筛效应,琼脂糖凝胶由交联的琼脂糖分子形成网状结构,孔径大小与琼脂糖浓度反比。当DNA通过凝胶时,受到凝胶孔径的阻碍。较小的DNA片段可以通过凝胶孔隙,而较大的DNA片段会受到阻挡而移动速度减慢。这种分子筛效应使得琼脂糖凝胶电泳能够有效地分离不同大小的DNA片段,为分子生物学研究提供了重要的工具和方法。
三、琼脂糖凝胶的制备过程是怎样的?
琼脂糖凝胶的制备过程相对简单,主要包括以下几个步骤:

准备材料:

  • 琼脂糖粉末:根据实验需要选择合适的琼脂糖浓度。

  • 电泳缓冲液:常用的有TAE缓冲液(Tris-Acetate-EDTA)或TBE缓冲液(Tris-Borate-EDTA)。

  • 核酸染料:如乙酰胺基苯甲酰胺(Ethidium Bromide, EB)或金胺G(GelRed)等,用于染色核酸,使其在紫外光下可见。

  • 微波炉或水浴锅:用于加热琼脂糖使其溶解。

  • 凝胶模具和梳子:用于形成凝胶的形状和样品孔。

  • 量筒、烧杯等基本实验器材。
配制琼脂糖溶液:
  • 根据实验需要,准确称量一定量的琼脂糖粉末。

  • 将琼脂糖粉末加入到一定体积的电泳缓冲液中,通常是1X TAE或TBE缓冲液。

  • 将烧杯放入微波炉或水浴锅中加热,直到琼脂糖完全溶解。注意避免琼脂糖溶液沸腾溢出。
冷却琼脂糖溶液:
  • 琼脂糖溶液在加热后需要稍微冷却,以防止过热。通常冷却至60-65°C左右,这个温度足以使琼脂糖保持液态,但不会烫伤操作者。
添加核酸染料:
  • 在琼脂糖溶液冷却后,加入适量的核酸染料。EB的常用浓度为0.5μg/mL,但需注意EB具有致突变性,操作时应小心,并在紫外光下避免直接接触。
倒入模具:
  • 将冷却后的琼脂糖溶液倒入凝胶模具中,插入梳子形成样品孔。

  • 让琼脂糖溶液在室温下或4°C下凝固,通常需要30分钟到1小时。
安装凝胶:
  • 琼脂糖凝胶凝固后,小心地取出凝胶,放入电泳槽中。

  • 在电泳槽中加入足够的电泳缓冲液,确保凝胶完全浸没。
进行电泳:
  • 加载样品到凝胶孔中,连接电源,设置适当的电压进行电泳。

  • 电泳完成后,关闭电源,取出凝胶,在紫外光照射下观察和拍照记录结果。

琼脂糖凝胶的制备过程需要小心操作,特别是在处理核酸染料时,因为它们可能对健康有害。此外,操作过程中应始终佩戴防护眼镜和手套。

免责声明:本号对所有原创、转载文章陈述与观点均保持中立,内容仅供读者学习和交流。文章、图片等版权归原作者享有,如有侵权,请留言联系更正或删除。

学术策
最前沿的科研资讯,最有料的科研资源,帮你打通科研路上的第—步!
 最新文章