一、琼脂糖凝胶的特性
透明度好:琼脂糖凝胶溶解快,胶液清澈透明,有利于观察和分析。
高强度:琼脂糖凝胶具有较高的强度和弹性,即使是低浓度的凝胶也不易破碎,保证了实验的稳定性。
低电内渗:琼脂糖凝胶的电内渗(EEO)较低,减少了对电泳质点迁移与分离的影响,这对于精确的电泳分析非常重要。
极低的背景:琼脂糖凝胶没有其他荧光物质干扰,泳带与背景黑白分明,拍摄的图片效果好,便于结果的观察和记录。
无核酸酶和蛋白酶:琼脂糖凝胶不含有核酸酶和蛋白酶,因此不会对DNA或蛋白质造成降解,是理想的惰性载体,适合用于生物大分子的分离。
凝胶制备简单:琼脂糖在水中加热到90℃以上溶解,温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶,这是它具有多种用途的主要特征和基础。
凝胶性能:琼脂糖凝胶性能通常用凝胶强度表示,强度越高,凝胶性能越好。质量较好的琼脂糖强度通常在1200克/cm²以上(1%胶浓度)。
亲水性:琼脂糖具有亲水性,并几乎完全不存在带电基团,对敏感的生物大分子极少引起变性和吸附。
孔隙结构:琼脂糖凝胶的孔隙大小可以通过调整琼脂糖的浓度和制备条件来控制,这对于DNA或RNA片段的分离至关重要。
准备材料:
琼脂糖粉末:根据实验需要选择合适的琼脂糖浓度。
电泳缓冲液:常用的有TAE缓冲液(Tris-Acetate-EDTA)或TBE缓冲液(Tris-Borate-EDTA)。
核酸染料:如乙酰胺基苯甲酰胺(Ethidium Bromide, EB)或金胺G(GelRed)等,用于染色核酸,使其在紫外光下可见。
微波炉或水浴锅:用于加热琼脂糖使其溶解。
凝胶模具和梳子:用于形成凝胶的形状和样品孔。
量筒、烧杯等基本实验器材。
根据实验需要,准确称量一定量的琼脂糖粉末。
将琼脂糖粉末加入到一定体积的电泳缓冲液中,通常是1X TAE或TBE缓冲液。
将烧杯放入微波炉或水浴锅中加热,直到琼脂糖完全溶解。注意避免琼脂糖溶液沸腾溢出。
琼脂糖溶液在加热后需要稍微冷却,以防止过热。通常冷却至60-65°C左右,这个温度足以使琼脂糖保持液态,但不会烫伤操作者。
在琼脂糖溶液冷却后,加入适量的核酸染料。EB的常用浓度为0.5μg/mL,但需注意EB具有致突变性,操作时应小心,并在紫外光下避免直接接触。
将冷却后的琼脂糖溶液倒入凝胶模具中,插入梳子形成样品孔。
让琼脂糖溶液在室温下或4°C下凝固,通常需要30分钟到1小时。
琼脂糖凝胶凝固后,小心地取出凝胶,放入电泳槽中。
在电泳槽中加入足够的电泳缓冲液,确保凝胶完全浸没。
加载样品到凝胶孔中,连接电源,设置适当的电压进行电泳。
电泳完成后,关闭电源,取出凝胶,在紫外光照射下观察和拍照记录结果。
琼脂糖凝胶的制备过程需要小心操作,特别是在处理核酸染料时,因为它们可能对健康有害。此外,操作过程中应始终佩戴防护眼镜和手套。
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