流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种先进的生物技术，它利用流式细胞仪对快速直线流动中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选。这项技术以其快速、准确、客观的特点而闻名，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，以及计算机对数据的采集和分析技术。
流式细胞术的特点包括：
速度快：检测速度可达到每秒数千至上万个细胞。 灵敏度高：每个细胞上只需带有100~300个荧光分子即可被检测出来。 多参数：能够同时分析单个细胞或生物微粒的多个特征。 纯度高：可以将指定特征的细胞分选出来，目的细胞纯度高达99%以上。 无毒害：能够保持细胞不被破坏，继续进行无毒害的定性及定量分析及分选。
流式细胞术在生物学中的应用非常广泛，包括细胞凋亡检测与分析、细胞增殖检测与分析、细胞内钙离子浓度的检测与分析、细胞膜电位的检测与分析、细胞表面分子的检测与分析、细胞核酸分析、胞内活性氧水平的检测与分析、细胞内或细胞核内抗原检测与分析等。
流式细胞仪的结构包括激光光源及光束形成系统、流动室及液流驱动系统、光学系统（透镜、滤光片、小孔、聚焦光源）以及信号检测与分析系统（光电倍增管PMT、补偿电路）。流式细胞术的基本原理涉及到前向散射与侧向散射，其中前向散射光（FSC）信号的强弱与细胞的大小相关，而侧向散射光（SSC）信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关。
流式细胞术的发展历史可以追溯到1934年，当时Moldavan提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想。1953年，Crosland-Taylor将流体力学聚焦引入了细胞检测领域，奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。大约20年后，第一台商业化流式细胞仪上市，之后50年，流式细胞术被广泛应用于基础研究和临床诊断。
流式细胞术样品制备的常规规范涉及多个步骤，以下是详细的样品制备流程和注意事项：
样品需要制备成单颗粒悬液，以分析活细胞或固定细胞、细胞核、微生物或小颗粒，具体取决于分析目标。 在制备单细胞悬液时，主要考虑因素是尽量减少细胞死亡和碎片，以避免干扰荧光的准确测定。
样本制备优化：
使用过滤器（如40μm过滤器）去除样品中的团块。 添加某些染色液添加剂以减少细胞成团，例如EDTA（约1-5mM）减少阳离子依赖性细胞粘附，DNA酶（约0.1mg/mL）降解死细胞的DNA，减少细胞粘附。 从整个组织中获得细胞群体可能颇具挑战性，通常用胶原酶和胰蛋白酶来分解组织和解离细胞，避免过度消化，以免破坏目标抗原表位或影响细胞活力。
了解生物样品并保持细胞活力：
细胞制备的标准方案将取决于细胞来源。
非淋巴组织细胞制备：
使用剪刀或手术刀将组织切成小块，加入适当的酶稀释在PBS中，并根据酶制造商的说明在最佳温度下孵育。 通过轻柔的移液操作分散细胞，并使用细胞筛网（尼龙网）过滤以消除团块和碎片。收集细胞悬浮液于锥形管中。 以300-400 x g的速度离心细胞4-5分钟，2-8°C，弃去上清液。 用PBS重悬细胞沉淀，重复离心步骤。 最后，用流式细胞术染色缓冲液或其他选择的缓冲液重悬细胞沉淀，并进行细胞计数和活性分析。
将血液样本至少1:1稀释于PBS中，在锥形管中。 在稀释样本下层加入与原始样本体积相等的Ficoll。 在室温下，400 x g离心20分钟，不使用刹车。 在PBS和Ficoll层之间的界面收集PBMC到新鲜管中。 用PBS填充管子以洗涤细胞。 以300-400 x g的速度离心细胞4-5分钟，2-8°C，弃去上清液。 用流式细胞术染色缓冲液或其他选择的缓冲液重悬细胞沉淀，并进行细胞计数和活性分析。
细胞浓度调整：
最终细胞浓度调整为1 x 10^7^ 细胞/mL（不同实验可能需要不同的细胞浓度）。
以上步骤是流式细胞术样品制备的常规规范，确保样品制备的质量和实验结果的准确性。
在进行流式细胞术样品制备时，以下是一些重要的注意事项：
单细胞悬液的制备：
制备单细胞悬液是流式细胞术分析的关键。如遇有细胞团块应先用300～500目的细胞筛网过滤后，再上机检测。 标本采集后要及时固定或深低温保存，避免出血与坏死组织。 免疫荧光标本应注意死细胞和碎片的去除，要求每份样品中杂质、碎片、团块重叠细胞应<2％，尤其是稀少细胞或细胞亚群的测定时，否则这些细胞的非特异性荧光增加，会干扰免疫荧光测定。
选择合适的标记物，并确保其特异性、亲和力和荧光强度等符合要求。
避免非特异性荧光干扰：
使用蛋白封闭剂，封闭非特异结合位点，尤其在间接免疫荧光标记时必不可少。常用的蛋白封闭剂为0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。 荧光抗体染色后充分洗涤，注意混匀和离心速度，减少重叠细胞和细胞碎片。
对照样品的设置：
采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。
染色后避光：
保证细胞免疫荧光的稳定，注意染色后避光。
减少细胞死亡和碎片：
死细胞导致样品中出现团块，这些团块往往在免疫染色中粘附游离的抗体，且表现出更高水平的自发荧光，从而干扰荧光的准确测定。 制备过程中的碎片过多则会提高噪音水平，如果过量还会干扰目标细胞的测定。
过滤器的使用：
过滤器是从样品中去除团块的好工具。建议从40μm过滤器开始。
染色液添加剂的使用：
某些染色液添加剂可减少细胞成团，例如EDTA（约1-5mM）可减少阳离子依赖性细胞粘附，DNA酶（约0.1mg/mL）能降解死细胞的DNA，并减少细胞粘附。
组织解离：
从整个组织中获得细胞群体可能颇具挑战性。通常用胶原酶和胰蛋白酶来分解组织和解离细胞。避免过度消化，这会破坏目标抗原表位或影响细胞活力。
遵循这些注意事项，可以提高流式细胞术样品制备的质量和实验结果的准确性。
确保流式细胞术样品制备中细胞浓度合适，可以遵循以下步骤和注意事项：
细胞计数：使用血球计数板或自动细胞计数器来确定细胞的浓度。这是确保细胞浓度合适的基础步骤。 调整细胞浓度：根据流式细胞术的要求，通常需要将细胞浓度调整到1-5×10^6^细胞/mL。这个范围可以确保细胞在流式细胞仪中流动时不会过于拥挤，也不会过于稀疏，影响检测结果。 使用标准化的步骤：在调整细胞浓度时，应采用标准化的步骤，以确保每次实验的一致性。这包括使用相同的缓冲液和相同的重悬方法。 避免细胞聚集：在制备过程中，应尽量减少细胞聚集和碎片，因为这些因素会影响细胞计数的准确性和流式细胞仪的检测结果。 使用适当的染色和标记：在进行流式细胞术之前，可能需要对细胞进行染色和标记。确保这些步骤不会影响细胞的浓度或活力。 避免细胞死亡：细胞死亡会导致细胞碎片的增加，这可能会干扰流式细胞仪的检测。因此，在制备和染色过程中，应尽量减少细胞的死亡。 使用适当的缓冲液：在重悬细胞时，使用适当的缓冲液，如流式细胞染色缓冲液（Flow Cytometry Staining Buffer），以保持细胞的稳定性和活力。 定期检查：在样品制备过程中，定期检查细胞的浓度和活力，确保它们在实验过程中保持在合适的范围内。 避免细胞损伤：在操作过程中，应尽量减少对细胞的物理损伤，如避免剧烈的涡旋混匀或高速离心，这些都可能导致细胞的损伤和死亡。
