His标签蛋白纯化是一种常用的蛋白质纯化技术，它利用His标签（6个连续的组氨酸残基，即6xHis）与金属离子（通常是镍离子Ni2+）之间的特异性结合来实现目标蛋白的纯化。以下是His标签蛋白纯化的详细介绍：
蛋白纯化是将目标蛋白从样本的总蛋白中分离出来，同时保留其生物学活性和化学完整性。His标签蛋白纯化利用His标签与金属离子的结合特性，通过固定金属离子亲和层析（IMAC）技术实现纯化。
His标签蛋白纯化技术：
His标签蛋白纯化通常使用Ni-NTA/TED Agarose Resin作为介质，这是一种以高度交联的琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联NTA/TED为配体，螯合镍离子（Ni2+）而制备的介质。
纯化过程包括样品的上样、洗杂和洗脱。在纯化过程中，带有His标签的重组蛋白能够特异性地结合到填料中的镍离子上，而其他蛋白则不能被结合。洗涤后，His标签重组蛋白可以在非变性条件下被洗脱，从而实现分离纯化。
His标签蛋白纯化的优势：
His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达。 采用IMAC纯化His-Tag融合蛋白操作简便。 His-Tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响，不会改变目的蛋白的可溶性和生物学功能。 His-Tag非常小，一般不影响蛋白质的功能，且在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响。 His-Tag的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体。 与其它亲和标签构建成双亲和标签，并可应用于多种表达系统。
His标签蛋白未挂柱可能受到多种因素的影响，以下是一些主要的影响因素：
His标签丢失或断裂：在大肠杆菌表达外源蛋白的过程中，可能会发生序列丢失的现象，导致His标签丢失，从而无法挂柱。可以通过Western-Blot方法使用His抗体检测目标蛋白是否存在His标签。 His标签未暴露在融合蛋白表面：如果His标签被“包埋”而暴露不出来，也会导致无法挂柱。可以尝试将标签构建于蛋白质的另一端，比如从N端改为C端，或者尝试变性后再过柱。 层析buffer问题：需要确认使用的层析buffer是否正确，包括平衡液和洗脱液，以及洗脱液的配方是否正确。特别是如果使用咪唑进行洗脱，需要确认其浓度是否足够，一般最高用到500mM。 溶液环境影响：pH、离子强度、其他蛋白质分子、缓冲溶液类型以及影响蛋白质分子表面的试剂等因素都可能影响蛋白质的折叠形态，导致His标签在折叠时没有位于蛋白质分子的表面上。 蛋白质溶解度问题：增加蛋白质样品的溶解度可能有助于暴露His标签。可以考虑增加变性剂浓度或类型，加大离子型、非离子型或两性离子表面活性剂的浓度，或适当调整盐浓度以增加蛋白质的可溶性。 孵育时间不足：增加孵育时间可能有助于提高His标签蛋白与柱子的结合效率。 非特异性疏水或其他相互作用：如果存在非特异性疏水或其他相互作用，可以考虑加入非离子去污剂到洗脱缓冲液中，或增加NaCl的浓度。
综上所述，His标签蛋白未挂柱可能涉及多种因素，需要逐一排查并采取相应的解决策略。
二、蛋白纯化得到的蛋白比较杂的原因
蛋白纯化得到的蛋白比较杂可能由以下几个因素导致：
粗分离阶段的问题：在粗分离阶段，主要目的是将目的蛋白与其他细胞成分如DNA、RNA等分开。如果这个阶段的分离不够彻底，会导致杂蛋白的混入。使用的树脂需要具备高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽等特点，以快速将蛋白与污染物分开。 精细纯化阶段的分辨率不足：精细纯化阶段需要更高的分辨率，以区分目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白。如果使用的树脂颗粒不够小，或者树脂的选择性和柱效不佳，可能会导致杂蛋白的混入。 非特异性疏水或其他相互作用：如果存在非特异性疏水或其他相互作用，可能会导致杂蛋白与目标蛋白一起被纯化。解决方法是加入非离子去污剂到洗脱缓冲液中，或增加NaCl的浓度。 蛋白酶部分降解了标签蛋白：如果蛋白酶部分降解了标签蛋白，也会导致杂带的出现。解决方法是添加蛋白酶抑制剂。 杂质对镍离子有更高的亲和性：如果杂质对镍离子有更高的亲和性，可能会导致杂蛋白的混入。解决方法是优化咪唑浓度，以确保高纯度和高产率之间的最佳平衡。 杂质和标签蛋白结合在一起：如果杂质和标签蛋白结合在一起，可能会导致杂蛋白的混入。解决方法是在超声破碎细胞之前加入去垢剂或者还原剂，增加去垢剂的浓度，或者在Wash buffer中增加甘油的浓度以减少非特异性的相互反应。 洗涤不充分：如果洗涤不充分，也可能会导致杂蛋白的混入。解决方法是增加洗涤的次数，使洗涤充分。 样品和溶剂的黏度差异：保证样品和溶剂的黏度接近，调整样品的条件使其与洗脱缓冲液的类似，以避免杂蛋白的混入。 层析柱长度不合适：调整层析柱长度，柱子过短使蛋白质分离不充分，而柱子过长则使得蛋白质样品扩散严重，影响纯化效果。 柱子填装效果不佳：如果柱子填装效果不佳，如介质颗粒没有分布均匀或者填装时带入气泡，蛋白质将不能顺利地流过固定相，影响纯化效果。
综上所述，蛋白纯化得到的蛋白比较杂可能是由于多种因素综合作用的结果，需要针对具体情况进行分析和优化。
二、为什么蛋白纯化目的蛋白未洗脱
蛋白纯化过程中目的蛋白未洗脱可能由以下几个原因导致：
洗脱条件太温和：洗脱液中的竞争洗脱成分（如咪唑浓度）不足，离子强度（如NaCl浓度）不够，洗脱体积不足，洗脱时间不够，洗脱溶液的pH不适合，或洗脱成分失效（如GST蛋白洗脱液需现用现配）。 非特异性疏水吸附或沉积：特别是针对水溶性差的蛋白，可能需要在裂解、洗涤、洗脱液中添加0.5%-2%的Triton X-100或Tween-20，或1-2M尿素（蛋白不会变性），甚至4-8 M 尿素或4-6 M 盐酸胍使蛋白变性洗脱。 蛋白间形成聚集：对于具有丰富二硫键的蛋白，可以在缓冲液中加入1-2mM DTT或1-5mM巯基乙醇来减少聚集。 配体与标签间相互作用过强：可能需要增大特异性竞争分子浓度或调节条件更严格（非特异性）来促进洗脱。 蛋白质柱上聚集：可能需要调整缓冲液到更利于保持蛋白质稳定性的条件。 洗脱条件不够严格：可能需要增大特异性竞争分子浓度，或调节条件（非特异性）来提高洗脱效率。 纯化过程中蛋白质失活：蛋白质去折叠或聚集，可能需要调整缓冲液到更利于保持蛋白质稳定性的条件。 保持活性必要的辅因子在纯化过程中被除去：可能需要添加辅因子来保持蛋白质活性。
针对上述问题，可以通过调整洗脱条件、添加适当的辅助剂、改变缓冲液成分等方法来提高目的蛋白的洗脱效率。
三、柱子进气
