CCK8是一种基于四唑盐WST-8的细胞增殖和毒性检测试剂盒，其原理是利用活细胞中的脱氢酶将WST-8还原为水溶性的黄色甲瓒产物，该产物的生成量与活细胞数量成正比，通过测定甲瓒的生成量即可量化评估细胞的增殖和毒性，因其操作简便、灵敏度高、对细胞毒性小等优点，广泛应用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定等领域。
使用方便，无需洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； 检测快速，灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度； 重复性优于MTT法，产生的formazan是水溶性的，减少因洗涤和溶解带来的误差； 对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；无需预制，即开即用。
细胞复苏与培养：首先将细胞从冻存状态复苏，并在适宜条件下培养至适合进行实验的密度。 细胞计数与接种：使用胰酶消化细胞后，进行细胞计数，并在96孔板中接种适量的细胞悬液，通常每孔100μL，细胞数量根据实验需求而定，如7000个细胞/孔。 预培养：将接种好的96孔板放入培养箱中预培养，直至细胞贴壁生长良好。 药物处理（如有必要）：如果实验需要测试药物对细胞增殖的影响，可以在细胞培养一定时间后向培养板中加入不同浓度的药物。 CCK8添加：在实验的指定时间点，向每孔中加入10μL的CCK-8溶液。 孵育：将加入CCK-8的培养板放回培养箱中孵育，时间一般为1-4小时，具体时间根据实验优化。 吸光度测定：使用酶标仪在450nm处测定每孔的吸光度，以评估细胞活性。 数据分析：根据吸光度值，使用Excel或Graphpad Prism等软件进行数据处理和分析，得出实验结果。
注意事项包括：
摸索最佳条件：初次实验时，建议先摸索接种细胞的数量和达到实验要求的培养时间，因为不同细胞的生长速度不同。 细胞悬液混匀：接种时细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀导致每孔中的细胞数量不一致。 培养板边缘孔处理：培养板周围一圈孔培养液容易挥发，为减少误差，建议这些孔只加培养基、PBS或水。 药物浓度梯度设置：药物样本初筛时可以适当减少浓度梯度的数量，增大浓度梯度间的倍数。若要确定样本的IC50则需要增加浓度梯度的数量。 血清影响考虑：加入样本时要注意培养基中血清浓度对样本的影响，部分样本可能受血清影响较大，此时需使用无血清培养基培养细胞。 样本更换培养基：若样本有氧化性或还原性，可在加入CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉待测药物的影响。 CCK-8添加技巧：加CCK-8时，建议斜贴着培养板壁加入，不要插到培养基液面下，容易产生气泡，干扰OD值。加入CCK-8后轻轻震培养板，避免加样时由于CCK-8残留在枪头或壁上所带来的误差。 CCK-8保存：CCK-8反复冻融会增加背景值，干扰实验测定，因此应避免反复冻融。
确保CCK8实验中细胞活性测量准确的关键在于遵循一系列精确的操作步骤和注意事项。以下是一些关键点：
细胞悬液混匀：在接种细胞时，确保细胞悬液充分混匀，避免细胞沉淀导致每孔中细胞数量不一致。 多通道移液器使用：建议使用多通道移液器斜贴着培养板壁加样，以减少平行孔间的误差。避免直接插到培养基液面下加样，以减少气泡产生，这些气泡可能会干扰OD值的测量。 气泡处理：如果加样时产生了气泡，可以通过轻拍板壁或使用一次性针头戳破气泡。如果气泡无法去除且导致数值误差较大，考虑去除该数值。 边缘孔处理：细胞培养板最边缘一圈孔的培养液易挥发，为减少实验误差，建议这些孔只加入培养基。加样区周围一圈也建议加入培养基，以减少实验误差。 培养基更换：若细胞培养时间较长，培养基颜色或pH发生变化，建议更换培养基后再加CCK-8。 CCK-8的添加：CCK-8加入时，建议快速操作以减少试剂在移液器上的残留，并在加入后轻轻震动培养板，以避免由于CCK-8残留在枪头或壁上所带来的误差。 避免反复冻融：CCK-8反复冻融会增加背景值，干扰实验测定，因此应避免反复冻融。 设置复孔：实验时尽量多设置复孔，取平均值，以减少人为造成的数据不稳定。 控制OD值：实验时把OD值控制在1.0左右，以保证测量的准确性。 检测体系中的还原剂：CCK-8的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待检测体系中存在较多的还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。 样品的还原性测试：可以通过在不含细胞的待测溶液孔中加入CCK-8溶液并孵育后测定空白吸光度来判断待测溶液是否有还原性，据此调整实验步骤。
