细菌表达蛋白实验是一种常用的分子生物学技术，用于在细菌（通常是大肠杆菌）中生产和表达外源蛋白。以下是细菌表达蛋白实验的基本步骤和一些关键点：
将质粒与TE混匀后与感受态细胞混匀。 将感受态细胞放入4℃冰箱中30分钟，然后放入42℃水浴锅中热激90秒，再放回4℃冰箱中3分钟。 取200μL的LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中。
培养和涂平板：
将混合物放入摇床中（37℃，195r）培养30至60分钟（最佳45分钟）。 取出后离心（3000r/min，2分钟），去掉上清，留100μL左右上清悬浮沉淀。 吸取50μL悬液涂平板，并将对应抗性的平板放入37℃培养箱中预热20分钟。
过夜培养：
将涂有菌液的平板放入37℃培养箱中过夜（12至16小时）。
表达鉴定：
从平板中挑取单菌落至4支对应抗性的LB试管中，编号为“0”“1”“2”“3”。 将试管放入摇床中培养，单抗性3小时左右，双抗性4小时左右，测量OD值（0.6至0.8）。 从“0”号管中取700μL悬液加入到100μL（C=80%）的保种甘油中，震匀后放入-20℃冰箱冻存。 在“1”“2”“3”号试管中分别加入2μL的IPTG（终浓度0.5mM最适）。
诱导表达和温度控制：
根据载体类型选择适合的表达环境，例如PET/PGEX：15℃表达过夜；25℃表达6小时；37℃表达3至4小时。Pcold载体则全部在15℃下表达过夜。
融合蛋白表达：
在大肠杆菌中表达外源蛋白时，融合表达系统可以提高蛋白质的稳定性和可溶性，有助于蛋白质的正确折叠和纯化。
减少蛋白裂解的策略：
包括将蛋白质靶向细胞周质或培养基、在较低温度下培养细菌、选用蛋白酶缺陷的菌株、构建N-末端或C-末端融合蛋白等。
这些步骤概述了细菌表达蛋白实验的基本流程，具体的操作条件和细节可能会根据实验目的和所使用的表达系统有所不同。
在进行细菌表达蛋白实验时，有几个关键的注意事项需要特别考虑。首先，在选择细菌菌株时，应根据目标蛋白的表达情况选择适当的菌株，并避免选择自溶性过高的菌株，以减少非特异性蛋白质的释放。其次，在裂解细菌细胞壁时，选择合适的裂解方法如超声波破碎或使用裂解酶，并注意控制裂解条件避免蛋白变性。
裂解液的组成也至关重要，常用缓冲液、蛋白酶抑制剂等成分需根据目标蛋白的特性调整。此外，实验过程中应严格控制温度在4℃或更低以防止蛋白质降解，需提前预冷实验器材和试剂。最后，在离心分离过程中，选择适当的离心力和时间以分离蛋白质和细胞碎片，并小心收集上清液。
保护蛋白质稳定性也至关重要，可添加甘油或DTT来提高蛋白质的稳定性，避免暴露在常温环境中太长时间。细心遵循这些实验注意事项将有助于提高细菌表达蛋白实验的成功率。
在进行细菌表达蛋白实验时，以下是一些重要的注意事项：
蛋白酶抑制剂的使用：在蛋白纯化过程中，应在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，如PMSF，以防止蛋白降解。注意PMSF需新鲜配制，因为其在水溶液中30分钟内会失效。 抗生素的选择：如果使用氨苄青霉素进行筛选，可能会因为筛选条件缺失导致质粒不稳定。建议使用羧苄青霉素替代氨苄青霉素。 重组蛋白的毒性：重组蛋白可能对细菌细胞具有毒性作用。应选择更严格调控的系统用于表达，如BL21-AI。也可以考虑使用不同的表达系统，如pBAD系统。 溶解性问题：如果存在溶解性问题，可以尝试在诱导时降低温度或减少IPTG用量。也可以使用不同的、更严格的菌株进行表达。在表达期间，增加细菌培养基的葡萄糖含量至1%可能有助于提高溶解性。 密码子使用偏好：如果看到1-2条主带，可能表示密码子使用偏好导致了翻译过早终止。发生降解时，通常可看到梯度条带。在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂有助于防止降解。可以通过时间点实验来确定收细胞的最佳时间。 防止毒性基因本底水平表达：有多种措施可防止由毒性基因本底水平表达带来的问题，这些方法均基于T7或Champion™表达质粒的设计和构建是正确的。 诱导表达的温度控制：根据载体类型选择适合的表达环境，例如PET/PGEX：15℃表达过夜；25℃表达6小时；37℃表达3至4小时。Pcold载体则全部在15℃下表达过夜。 溶质量及溶液黏度控制：在表达鉴定分析时，注意控制溶质的量及溶液黏度，以便于后续的电泳检测。 样本制备：在细菌表达蛋白质和样本制备过程中，应注意使用适当的试剂和设备，如Tris-Cl缓冲液、SDS凝胶加样缓冲液、台式离心机、超声破碎仪等，并遵循正确的操作步骤。
遵循这些注意事项可以帮助提高细菌表达蛋白实验的成功率，并减少可能的问题。
在进行细菌表达蛋白实验时，常见的问题及解决方案如下：
蛋白质回收率低：裂解不完全或离心条件不适当。解决方法包括优化裂解条件，增加裂解时间或调整裂解方法，并调整离心条件以提高离心效率。 蛋白质降解：可能是由于蛋白酶活性过高或温度控制不当。解决方法包括加入蛋白酶抑制剂和严格控制操作温度。 非特异性蛋白质的共提取：可能是裂解方法过于粗糙或缓冲液选择不当。解决方法包括选择合适的裂解方法和调整缓冲液成分以减少非特异性蛋白的溶出。 蛋白质变性：可能由于超声处理过度或裂解液成分不适合目标蛋白。解决方法包括控制超声时间和调整裂解液配方以保持蛋白质的结构和活性。 蛋白质得率不稳定：可能由于细菌培养条件不一致或样品处理不当。解决方法包括统一细菌培养条件和标准化样品处理以确保稳定的蛋白质回收率。 提取液混浊或沉淀：可能是裂解后未及时离心或提取液成分导致沉淀。解决方法包括及时离心和优化裂解液成分以避免蛋白质的聚集和沉淀。
遇到这些常见问题时，及时采取相应的解决方案可以提高细菌表达蛋白实验的成功率和结果的准确性。
在细菌表达蛋白实验中，可能会遇到一些常见问题及其解决方案，以下是整理的一些关键点：
蛋白不表达：
原因：可能是由于稀有密码子导致的表达效率和水平低，或者基因本身的问题，如RNA 3'的特殊结构可能导致转录问题。 解决方案：如果含有多个稀有密码子，可以尝试使用Rosetta(DE3)菌株。如果是基因本身问题，可以尝试融合表达，例如使用pET-32a载体。
蛋白表达不理想或明显降解：
原因：可能是由于蛋白酶活性过高或者蛋白稳定性差。 解决方案：可以尝试使用BL21(DE3)-CodonPlus(DE3)菌株，这种菌株能够改善由于稀有密码子造成的表达限制。
蛋白表达为包涵体：
原因：蛋白折叠不正确或者表达条件不适宜。 解决方案：可以尝试使用OrigamiB(DE3)菌株，这种菌株有助于改善二硫键错误折叠的问题。同时，也可以考虑使用分子伴侣如ESL、KJE来提高可溶性。
过高的本底表达：
原因：可能是由于表达系统本身的调控机制问题。 解决方案：可以尝试使用BL21(DE3)pLysS菌株，这种菌株有助于减少本底表达。
质粒测序正确，蛋白无法表达：
解决方案：可以尝试改变表达条件，如梯度条件改变表达温度、IPTG浓度，低温、较长时间的表达有利于蛋白稳定、融合表达；低浓度的IPTG可以减少化学物质对细胞的损伤。
设计问题：
原因：可能包括信号肽未去除、密码子位移等。 解决方案：在原核表达时去除信号肽，优化密码子，考虑序列GC含量、蛋白大小等问题。
经济性及时效性：
解决方案：根据实验需求选择最合适的表达系统，大肠杆菌表达最快、成本最低，而哺乳动物表达成本较高，时间也较长。
技术熟练度及其他问题：
解决方案：根据实验者的技术熟练度选择技术路线，以减少实验过程中的弯路。
