实验注意事项及经验
在配制10%SDS溶液时，如果出现不溶的情况，可将其放入37℃水浴锅加热溶解，尤其是在冬天时更需要注意这一步。
配制胶液时，最后添加10%APS促凝剂，并用5ml移液枪轻轻吹打混合均匀。
在配制胶液时，水压线的水流速度不宜过快，应该保持水流均匀缓慢。
为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应立即进行转印操作。
在夏天温度较高时，进行电泳时需要注意加冰来降低温度，以防止高温导致凝胶溶解。
在进行转膜操作时，应正确放置PDVF膜与凝胶所对应的电极，确保凝胶对应负极，PDVF膜对应正极。在电泳过程中也要注意正负极的连接。
在取出凝胶后应注意准确分辨上下方向，可使用刀片切去一个凝胶角作为标记，以便区分正反面和上下关系。
在转膜完成后的操作中，务必注意保持膜的湿润，避免膜的干燥，以避免出现背景过大的问题。
新鲜配制的10×电泳液可在室温下保存，而稀释后的1×电泳液应存放在4℃冰箱内保存。为保持所需的离子强度和pH值，一般可以在冰箱保存约三天左右。
使用完30%Acylamide后，应立即置于冰箱保存。
蛋白类制剂不宜经常反复冻融，以防止降解影响实验结果。
在进行Western Blot实验时，严格遵守以上注意事项将有助于保证实验的顺利进行和结果的准确性。
样本质量：确保样本中蛋白质的含量足够，并且蛋白质变性充分。样本的pH值应在7-8之间，以保证蛋白质的稳定性。
蛋白裂解：选择合适的裂解液（如RIPA裂解液），并加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白质降解。
蛋白定量：使用BCA或Bradford方法定量蛋白质，以确保每个样本的上样量一致。
凝胶制备：使用SDS-PAGE进行蛋白质分离，确保凝胶的pH值稳定（分离胶pH约为8.8，浓缩胶pH约为6.8）。
上样与电泳：每个泳道的上样量应一致，避免过载。使用预染蛋白Marker监控电泳过程。
膜的选择：常用的转印膜有PVDF膜和NC膜。PVDF膜适用于高分子量蛋白，NC膜适用于低分子量蛋白。
转膜方法：湿转法是最常用的转膜方法，适用于大多数蛋白质。确保膜和滤纸的大小与凝胶一致，避免电流不均匀。
封闭液的选择：常用封闭剂有脱脂奶粉和牛血清白蛋白（BSA）。脱脂奶粉适用于大多数情况，但不适用于磷酸化蛋白。
封闭时间：通常在室温下封闭1-2小时，或在4℃下过夜。
一抗孵育：选择高质量的单克隆抗体，孵育时间和温度应根据抗体说明书进行优化。
二抗孵育：二抗通常在室温下孵育1小时，确保二抗与一抗的种属匹配。
显色方法：使用高灵敏度的化学发光底物（如ECL）进行显色。
背景控制：确保封闭充分，避免非特异性结合。增加洗涤次数和时间以降低背景。
条带模糊：可能是蛋白样品降解或上样量过多，建议优化样品处理和上样量。
背景高：可能是封闭不充分或抗体浓度过高，建议调整封闭液和抗体浓度。
无信号：可能是抗体失效或蛋白表达量低，建议检查抗体质量和增加上样量。
将组织样品在液氮中迅速冷冻并研磨成粉末。
加入适量的裂解液（如RIPA裂解液），并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。
在冰上孵育30分钟，期间间歇性涡旋混合。
4℃，12000 rpm离心20分钟，收集上清液作为蛋白样品。
配制BCA工作液（50:1混合试剂A和试剂B）。
在96孔板中加入标准品和样品，每孔加入200 µL BCA工作液。
37℃孵育30分钟后，在562 nm处测定吸光值。
根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
配制分离胶和浓缩胶溶液，分别加入TEMED和APS以启动聚合。
将分离胶灌入玻璃板间，加入适量的异丙醇平整表面，待凝固后倒掉异丙醇。
加入浓缩胶，插入梳子形成进样孔。
使用去离子水和乙醇清洗玻璃板，确保无残留物。
用滤纸擦干玻璃板，避免气泡。
将样品与上样缓冲液混合，95℃加热5分钟使蛋白变性。
每孔加入等量的蛋白样品，避免溢出。
设置电泳仪，初始电压80V，待样品进入分离胶后提高至120V。
电泳至溴酚蓝染料前沿到达凝胶底部。
准备转膜缓冲液，浸泡PVDF膜（需预先用甲醇活化）。
组装转膜夹：从下至上依次为纱布、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、纱布。
在4℃下以100V转膜1-2小时。
剪膜：根据蛋白Marker剪切PVDF膜，标记位置。
封闭：用5%脱脂奶粉或BSA在室温下封闭1小时，或4℃过夜。
一抗：按推荐稀释比例在4℃孵育过夜。
洗膜：用TBST洗膜3次，每次10分钟。
二抗：按推荐稀释比例在室温孵育1小时。
再次用TBST洗膜3次，每次10分钟。
将ECL显影液均匀覆盖在膜上，孵育1-2分钟。
在暗室中用X光片或化学发光成像系统曝光，记录结果。
通过对比蛋白Marker确定目标蛋白的分子量。
分析条带的强度和位置，判断蛋白表达水平和特异性。
使用内参蛋白（如β-actin）进行标准化，确保结果的可靠性。
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