王桂华教授
【引用本文】王桂华，周颖彬. 胃癌免疫治疗获益人群选择[J]. 中国实用外科杂志,2024,44(10):1138-1143.
目前，测定胃癌预测性生物标记物是筛选胃癌免疫治疗获益人群最有效的方法。程序性死亡配体-1（PD-L1）表达评分是目前广泛使用的一个评估胃癌免疫治疗疗效的临床生物标记物，但仍需要进一步规范其测定平台、评价指标及指标截止值。虽然微卫星不稳定状态、肿瘤突变负荷水平和EB病毒感染在某些胃癌免疫治疗临床试验中具有良好的预测价值，但仍需要大规模的临床研究进一步验证。POLE/POLD1突变、幽门螺杆菌感染以及液体活检为胃癌免疫治疗预测性生物标记物的研究开辟了新的方向。目前，对于筛选胃癌免疫治疗获益人群仍无准确标准，使用包括PD-L1表达评分在内的多项预测指标共同判定，可能有助于提高筛选的准确性。
基金项目：湖北省自然科学基金创新群体项目（No. 2021CFA006）；华中科技大学基础研究支持计划项目（No. 2023BR036）
作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院胃肠外科，湖北武汉 430030
通信作者：王桂华，E-mail：ghwang@tjh.tjmu.edu.cn
1 PD-L1评分在筛选胃癌免疫治疗获益人群中的应用
PD-L1是表达于肿瘤细胞和肿瘤相关抗原提呈细胞上的关键配体蛋白，其与T细胞上的PD-1结合导致T细胞失活，使肿瘤细胞逃避宿主的免疫反应。以PD-L1或PD-1为靶点的ICIs可以干预这个过程，激活T细胞的抗肿瘤免疫反应。PD-L1蛋白表达水平与其治疗效果相关，免疫组化（IHC）是检测PD-L1蛋白表达水平的主要手段，IHC指标联合阳性评分（combined positive score，CPS）、肿瘤区域阳性评分（tumor area positivity，TAP）和肿瘤比例评分（tumor proportion score，TPS）可以用于评估PD-L1的表达水平，已有临床研究评估了CPS、TAP、TPS作为胃癌中免疫治疗预测性生物指标的效能。CheckMate-649临床试验应用CPS指标研究纳武利尤单抗（nivolumab）联合化疗的治疗效果，在CPS≥5的病人群体中，纳武利尤单抗联合化疗组中位总生存期（overall survival，OS）达14.4个月，相较于单独化疗组的11.1个月，展现了显著的生存优势［5］。基于此试验，纳武利尤单抗获批用于晚期或转移性胃癌病人的一线治疗。ORIENT-016是一项针对我国胃癌病人进行的Ⅲ期临床研究，验证化疗联合或不联合信迪利单抗（Sintilimab）治疗效果的差异。对于CPS≥5的胃癌病人，信迪利单抗组中位OS为18.4个月，安慰剂组中位OS为12.9个月；对于CPS<5的胃癌病人，信迪利单抗组中位OS为11.7个月，安慰剂组中位OS为12.0个月，化疗联合信迪利单抗对CPS≥5胃癌病人有明显生存获益［6］。多中心、随机、双盲Ⅲ期临床试验KEYNOTE-859分层分析帕博利珠单抗（Pembrolizumab）对不同CPS水平胃癌病人的治疗效果，在所有试验病人中，帕博利珠单抗组的中位OS为12.9个月，而安慰剂组为11.5个月；在PD-L1 CPS≥1病人中，帕博利珠单抗组中位OS为13.0个月，而安慰剂组为11.4个月；在PD-L1 CPS≥10病人中，帕博利珠单抗组中位OS为15.7个月，而安慰剂组为11.8个月。与CPS≥1病人比较，CPS≥10的病人接受免疫治疗后获益更多［7］。TPS及TAP也应用于临床研究之中。Ⅱ/Ⅲ期临床研究ATTRACTION-4中， 随机对人类表皮生长因子受体-2（HER-2）阴性、不可切除、晚期胃癌病人使用化疗联合或不联合纳武利尤单抗治疗，在筛选期间使用IHC 28-8pharmDx试剂盒对肿瘤组织进行PD-L1 TPS测定，TPS≥1%的病人中位OS并未高于TPS<1%的病人［8］。ATTRACTION-5研究将胃癌术后辅助治疗在化学治疗基础上增加纳武利尤单抗，虽然在总研究人群中不能够显著提高无复发生存期（recurrence free survival，RFS），但值得注意的是，在亚组分析中TPS≥1%的病人能够在纳武利尤单抗加入后得到显著获益，这意味着对于PD-L1表达阳性的病人，术后采用免疫药物辅助治疗仍具有重要价值［9］。上述两项临床试验结果的差异性反映了TPS在预测胃癌免疫治疗疗效中的作用存在争议。一项基于CheckMate-032临床试验的后续探索性分析发现，CPS≥5和≥10是比TPS更准确的免疫治疗疗效的预测性标记物，此外，炎症基因特征也具有反映免疫调节和预测细胞毒性反应的能力，有可能成为胃癌免疫治疗的预测性标记物［10］。CPS的计算方法中囊括了表达PD-L1的肿瘤细胞和表达PD-L1的淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞，而TPS是按照表达PD-L1的肿瘤细胞相对于样本中所有肿瘤细胞染色的百分比计算。研究结果表明，以粒细胞为代表的免疫细胞参与肿瘤适应性免疫，CPS作为一种预测性肿瘤标记物，不仅评估了肿瘤恶性潜力，更评估了宿主的免疫状态，CPS较TPS更适合在预测胃癌免疫治疗效果过程中代表PD-L1表达量［11］。此外，Liu等［12］研究认为，TAP与CPS在检测PD-L1表达阳性病人方面一样有效，并且耗时更短。RATIONALE-305研究分析TAP与免疫治疗总生存率之间的关系，分别对晚期胃癌病人使用化疗联合或不联合替雷珠单抗（Tislelizumab）方案治疗，相较于TAP<5%的病人，在TAP≥5%的病人中，免疫治疗联合化疗的总体生存获益更大［13］。 虽然PD-L1评分有助于预测胃癌免疫治疗效果，但在实际应用中仍存在局限性。目前，有较多平台及试剂用于检测PD-L1表达量，FDA已批准22C3、28-8、SP142和SP263这4种抗体用于检测PD-L1蛋白的表达水平，不同平台和试剂所测试出的PD-L1评分不尽相同。Klempner等［14］使用28-8、22C3和SP263抗体对CPS和TAP 2种评分算法进行比较，发现虽然在较低的分析截止值（CPS≥1和TAP≥1%），SP263与28-8和22C3检测出来的CPS和TAP表现出适度的一致性，但SP263检测的CPS和TAP得分通常高于22C3和28-8。Yeong等［15］研究发现，分别以CPS≥1、≥5、≥10为截止值时，使用28-8检测的PD-L1阳性样本的百分比约为22C3的2倍，该结果不支持PD-L1 IHC中DaKo 22C3、DaKo 28-8和Ventana SP-142检测之间的可互换性。这些均说明使用不同抗体进行IHC检测会影响PD-L1表达评分的最终结果。即便目前有大量的临床研究结果表明高表达PD-L1蛋白的晚期胃癌病人能够有着较好的免疫治疗效果，但部分个体在接受免疫治疗后疗效不佳的情况也时有发生。笔者团队的既往研究结果发现组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶（SETD7）触发的PD-L1 K172甲基化在PD-1和PD-L1相互作用中发挥负调控作用，导致PD-L1高甲基化的肿瘤对ICIs治疗产生耐药［16］。此外，由于免疫治疗可能通过多种机制发挥作用，部分缺少PD-L1表达的病人也可能对免疫治疗有反应。在目前的临床试验中，使用了不同的抗体及判读方式来评估PD-L1表达，PD-L1截止值缺乏统一的标准并难以重复，这都需要进一步的研究来完善。
2 MSI-H和dMMR在筛选胃癌免疫治疗获益人群中的应用
错配修复（MMR）系统由几种蛋白质组成，其中包括hMLH1、hMSH2、hMSH6和hPMS2基因的产物，这些基因监测正确的DNA复制，微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）是指DNA失去错配修复的功能后，不能修复与DNA复制相关的错误，导致出现基因组突变积累的现象。MSI-H肿瘤中基因突变蛋白表达增多，诱导特异性T细胞的产生，促进对癌细胞的杀伤［17］。已有研究结果表明，MSI-H胃癌病人对ICIs具有良好的反应性。KEYNOTE158 试验研究不同癌种dMMR/MSI-H与帕博利珠单抗疗效之间的关系，51例dMMR/MSI-H的胃癌病人表现出对帕博利珠单抗持续应答，客观缓解率（ORR）为31%，中位OS为11.0个月，中位PFS为3.2个月［18］。Chao等［19］对KEYNOTE-059、KEYNOTE-061和KEYMOTE-062研究中的MSI/dMMR胃癌病例进行回顾性分析，系统分析了MSI-H对帕博利珠单抗应用于晚期胃癌治疗的预测价值。KEYNOTE-059研究中总人群ORR为11.6%，MSI-H病人为57.1%；KEYNOTE-061研究中，总人群中帕博利珠单抗组ORR为11.1%，与化疗组的12.5%相当，MSI- H病人中帕博利珠单抗组为46.7%，显著优于化疗组的16.7%；KEYNOTE-062研究中，总人群中帕博利珠单抗组、帕博利珠单抗联合化疗组、化疗组ORR分别为14.8%、48.6%、37.2%，相较于化疗，免疫治疗未体现出优势，MSI-H病人中帕博利珠单抗组、帕博利珠单抗联合化疗组、化疗组ORR分别为57.1%、64.7%、36.8%，免疫单药治疗或联合化学治疗相较于单纯化疗有明显提升，这些结果说明帕博利珠单抗单药治疗或联合化疗对晚期dMMR/MSI-H胃癌病人均具有持久的抗肿瘤效果。KEYNOTE-585临床试验研究局部可切除胃癌病人在新辅助治疗过程中应用ICIs的疗效，MSI-H组病人的完全病理缓解（pathological complete response，pCR）率明显高于非MSI-H组病人［20］。可知，MSI-H病人可能对ICIs治疗高度敏感，识别MSI-H及dMMR状态有助于筛选出能从免疫治疗中获益的胃癌人群。 目前，dMMR主要使用IHC对MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白进行检测，MSI使用多重聚合酶链式反应（PCR）对BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24等位点进行检测，MSI>40%可诊断为MSI-H，相较于dMMR，MSI检测耗时长，价格相对昂贵，对实验室条件要求高，在临床上未完全普及［21］。根据既往研究报道，MMR蛋白IHC和MSI分子检测存在着不一致性，发生率为1%~10%，但在规范检测、避免检测错误的前提下，任何一种方法检测阳性均可作为晚期肿瘤病人使用ICIs治疗的依据［22］。
3 TMB在筛选胃癌免疫治疗获益人群中的应用
TMB是量化肿瘤基因组突变数目的常用指标。DNA突变被加工成新抗原，以主要组织相容性蛋白呈现给T细胞，具有高TMB的肿瘤细胞被认为具有更多的新抗原，更容易被免疫系统识别和靶向，从而促进免疫细胞杀伤肿瘤细胞，提高免疫治疗效果。基于KEYNOTE-158研究结果，帕博利珠单抗获批用于单药治疗既往不可切除或转移性TMB-H实体瘤（定义为TMB≥10个突变/Mb）。Shitara等［23］对KEYNOTE-061临床试验进行探索性分析，将全外显子测序（WES）评估的高组织肿瘤突变负荷（tTMB-H）定义为tTMB≥175个突变/外显子，在tTMB<175个突变/外显子病人人群中，化疗组中位OS为8.8个月，帕博利珠单抗组病人中位OS为5.7个月，未见免疫治疗获益；在tTMB≥175个突变/外显子病人人群中，化疗组中位OS为8.1个月，帕博利珠单抗组中位OS为16.4个月，帕博利珠单抗单药治疗效果明显优于单纯化疗，在排除了MSI-H肿瘤病人后，tTMB≥175个突变/外显子人群中，帕博利珠单抗组中位OS为15.5个月，明显优于化疗组中位OS 8.2个月，tTMB仍然与免疫治疗疗效相关。同时，该团队发现TMB和PD-L1表达量之间有较低的联系，这提示TMB可以作为预测性生物标记物独立指导免疫治疗用药。对KEYNOTE-062试验的探索性研究中以TMB≥10个突变/Mb作为临界值，评定TMB在临床中的使用［24］。结果显示，在将帕博利珠单抗联合化疗组和单纯化疗组进行比较时，TMB-H病人中位OS具有更明显的差异（31.6个月vs.13.4个月），较非TMB-H组（7.5个月vs.12.6个月）获益更多。表明TMB水平与胃癌病人一线使用帕博利珠单抗联合化疗的治疗效果之间有着明显的关联。此研究在排除了MSI-H肿瘤病人后，TMB的预测能力发生了衰减，这提示TMB与其他生物预测指标联合使用具有更好预测ICIs治疗效果的能力。虽然TMB是一个具有广阔前景的生物预测指标，但是目前仍需要更多前瞻性或者随访试验来标准化TMB检测方式及平台，以期确定预测胃癌免疫治疗疗效的最佳TMB临界值。
4 EBV阳性在筛选胃癌免疫治疗获益人群中的应用
EBV是一种常见的人类疱疹病毒，与多种恶性肿瘤有关，EBV阳性胃癌约占胃癌的9%［25］。EBV阳性胃癌表现出独特的组织学和免疫学特性，EBV阳性胃癌与dMMR相互排斥，PD-L1在EBV阳性胃癌中明显表达过高。EBV阳性胃癌主要由两种不同机制引起PD-L1的过度表达：CD274的扩增导致PD-L1过度表达；通过激活干扰素调节因子3（IRF3）通路上调IFN-γ的产生，导致过表达PD-L1。这使得EBV阳性胃癌病人对于ICIs治疗更加敏感［26］。 一项前瞻性Ⅱ期临床试验对61例转移性胃癌病人进行帕博利珠单抗治疗，发现6例EBV阳性胃癌病人均获得部分缓解（PR），中位缓解时间延长为8.5个月，这说明EBV阳性胃癌可能是一个对免疫治疗高获益的人群［27］。然而，在另一项前瞻性Ⅱ期临床试验NCT03755440中，6例EBV阳性胃癌病人在接受了卡瑞利珠单抗（Camrelizumab）治疗后，均未获得PR或完全缓解（CR）的效果［28］。虽然EBV阳性胃癌是胃癌中的一种重要亚型，且部分EBV阳性胃癌病人对于ICIs表现持续有效的反应，但是EBV感染和胃癌免疫治疗之间的关系仍然存在着争议。诊断EBV阳性的金标准长期以来一直是EBV编码的RNA原位杂交（EBER-ISH），存在着假阳性或假阴性的情况，并且不允许同时测量胃癌免疫治疗中的其他预测性生物标记物（MSI、PD-L1）［29］。未来仍需进一步研发新一代的检测技术为确诊胃癌EBV提供便利，同时开展大规模的临床试验来确证EBV阳性在免疫治疗中的预测性价值。
5 其他预测性标记物在筛选胃癌免疫治疗获益人群中的应用
POLE和POLD1基因编码的效应蛋白DNA聚合酶ε和δ具有核苷酸修复功能，若肿瘤细胞中POLE/POLD1基因发生错义突变，会导致更多的基因突变。Zhu等［30］收集并分析了613例胃腺癌病人的基因检测数据，结果显示，POLE/POLD1突变的总频率为7.99%，这部分出现POLE/POLD1突变的胃腺癌病人具有更高的PD-L1表达水平、TMB、MSI-H占比，表现出适应性免疫抵抗肿瘤微环境（TME），所以POLE/POLD1基因突变可能意味着更好的ICIs治疗效果。目前，仍需大规模的临床试验来进一步验证POLE/POLD1突变作为胃腺癌ICIs免疫治疗的预测性生物标记物的临床意义。 幽门螺杆菌（Hp）被认为是大多数早期胃癌的发病机制以及导致疾病进展的重要危险因素。既往研究结果表明，胃癌病人Hp感染与PD-L1表达之间存在关联，这说明Hp感染可能是胃癌对免疫治疗效果良好的预测性生物标记物［31］。有研究在免疫治疗前对10 122例胃癌病人进行Hp感染状态检测，结果显示，Hp阳性组的中位免疫相关整体生存期（irOS）较Hp阴性组延长4.1个月［32］。然而，仍缺乏Hp感染在胃癌免疫治疗中预后意义的前瞻性研究。此外，由于感染过程复杂，Hp感染对免疫的影响在个体间可能存在异质性。因此，Hp感染不能作为筛查胃癌免疫治疗获益人群的独立生物标记物，有必要进一步研究以更好地了解其在胃癌免疫治疗中的作用。
人工智能（包括机器学习和深度学习）越来越多地用于从生物医学数据中提取信息和发现新模式，既往有研究报道使用深度学习来预测免疫治疗的疗效。李国新团队利用深度学习模型从胃癌全视野病理切片图像提取3类病理组学特征：细胞核特征、单细胞空间分布特征和深层微环境特征，并开发了一个病理组学驱动的集成模型（PDEM），以预测免疫治疗后胃癌病人的反应，该集成模型在筛选免疫治疗获益人群方面有着优异的表现，与CPS相比，该模型表现出更高的曲线下面积（AUC）、敏感度和特异度，可以识别低CPS病人中的潜在免疫获益人群，确定在高CPS病人中可能无法从免疫治疗中受益的个体［33］。Jiang等［34］基于CT影像开发出生物学引导深度学习（BgDL）模型，用以对胃癌病人TME状态进行分类并预测预后，在培训队列及内外部验证队列中，均实现了TME分类的高准确性。该模型能够对整个肿瘤进行无创动态评估，可预测晚期胃癌病人免疫治疗的获益情况，推动胃癌的个性化治疗。深度学习预测模型在筛选免疫治疗获益人群具有广阔的潜力，但其存在着可解释性较低的问题，同时已有的研究大部分为回顾性研究，仍需要更大的前瞻性队列进行进一步验证。
目前，胃癌诊断依赖于消化内镜检查，成本相对较高，具有一定侵入性，存在发生不良反应的可能。消化内镜下单个肿瘤活检可能不能代表肿瘤内异质性，从而导致治疗失败［35］。基于液体活检的血液预测性生物标记物具有可重复检测的优点，可以实时监测疾病进展和治疗反应，从而在筛选胃癌免疫治疗获益人群中发挥独特潜力。目前，广泛应用于胃癌的血液预测性生物标记物包括循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）和细胞外囊泡（EV）［36］。多项研究结果强调基于液体活检的血液生物标记物在预测和监测胃癌免疫治疗反应中的重要作用。Ishiba等［37］研究发现包括胃癌在内的各种癌症中循环肿瘤RNA（ctRNA）PD-L1的表达水平与肿瘤组织中的的PD-L1表达水平具有高度一致性，这两种方法均可用于预测纳武利尤单抗的治疗效果。EV中PD-L1表达也与免疫治疗反应之间存在相关性。Zhang等［38］研究确定了对免疫治疗有指导意义的血浆EV来源蛋白并将其表达水平合并为EV评分，用以预测免疫治疗的效果。结果表明EV评分≥1胃癌病人可以从ICIs治疗中获得了更多的益处。此外，AEGEAN研究在特定时间节点采集病人血浆ctDNA样本，发现新辅助化疗联合免疫治疗早期达到ctDNA清除的病人有望实现更高的pCR，提示ctDNA清除率可作为潜在的早期免疫治疗预测性生物标记物［39］。尽管液体活检有着可重复性、创伤小、比肿瘤活检经济等优势、然而该检测方法也有一定的局限性。首先，ctDNA只能少量释放，并非所有病人都能达到可检测水平，特别是对于肿瘤负担低的病人；其次，血液中的标记物不具有特异性，并非全都是从原发性或转移性肿瘤中脱落，因而无法明确检测到的改变能否代表肿瘤的异质性仍存疑［40］；最后，目前液体活检还未能实现标准化，不同的技术和方法会产生不同的结果，仍需要进一步探索以提高液体活检在胃癌免疫治疗生物标记物筛选中的可靠性。
综上所述，测定胃癌预测性生物标记物是目前筛选胃癌免疫治疗获益人群最有效的方法。PD-L1表达评分是目前广泛使用的一个评估胃癌免疫治疗疗效的临床生物标记物。然而，仍需要进一步规范PD-L1表达量的测定平台、评价指标及指标截止值。虽然MSI状态、TMB水平和EBV感染在某些胃癌免疫治疗临床试验中具有良好的预测价值，但仍需要大规模的临床研究以进一步验证。POLE/POLD1突变、Hp感染以及液体活检为胃癌免疫治疗预测性生物标记物的研究开辟了新的方向。目前对于筛选胃癌免疫治疗获益人群仍无准确标准，使用包括PD-L1表达评分在内的多项预测指标共同判定，可能有助于提高筛选的准确性。
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（2024-09-10收稿）
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