毕赤酵母表达重组蛋白工具篇(超详细!!!)

健康   2024-11-12 20:30   湖北  

导读

酵母表达系统是真核表达系统之一,常用的种类为酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii,又名Pichia.pastoris)。两者的遗传物质均已明确,具有相似的分子和基因操作优势,巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白水平比酿酒酵母高10-100倍。酿酒酵母难于高密度培养,分泌效率低,也不能使外源蛋白质正确糖基化,易发生质粒丢失,因此巴斯德毕赤酵母作为第二代酵母表达系统,其优势体现在遗传操作更加简易,蛋白表达水平更高,对蛋白修饰能力更强,已成为最新流行的细胞工厂


本文对巴斯德毕赤酵母的背景,工程化改造技术和在重组蛋白中的应用进行概览。


一、巴斯德毕赤酵母背景



巴斯德毕赤酵母(以下简称毕赤酵母)由Herman Phaff于1956年从橡树上分离的一类甲醇营养型酵母,命名为Pichia pastoris,1995年被重新归入Komagataella属,之后又被细分为Komagataella pastoris和Komagataella phaffii两个种。目前,广泛应用的毕赤酵母商业化菌株X33和GS115均归属K. phaffii种,但大部分文献和数据库仍在使用旧名P. pastoris。


毕赤酵母的甲醇代谢途径:通过醇氧化酶(Alcohol oxidases,AOX1/2)将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢,过氧化氢H2O2由过氧化氢酶(Catalase,CAT)催化分解成水和氧气,而甲醛则有两个去处:一部分甲醛则进入同化途径,在二羟丙酮合酶(Dihydroxyacetone synthase,Das1/Das2)和木酮糖单磷酸循环进行同化,再生3-酮糖-5-磷酸分子,同时构建一个甘油醛-3-磷酸作为生物质形成的前体;另一部分进入异化途径,甲醛氧化为甲酸生成CO2,产生细胞质NADH,既可用作还原当量,也可进入呼吸链提供ATP(图1)。

图1 P. pastoris的甲醇代谢途径



毕赤酵母的表型:在毕赤酵母表达系统中,醇氧化酶有两种基因编码,即AOX1和AOX2,AOX2的表达量比AOX1低得多,细胞中醇氧化酶活力主要由AOX1基因表达的AOX1蛋白提供。基于两种醇氧化酶基因的存在或缺失,存在三种不同的甲醇利用(Methanol utilization,Mut)表型,具有AOX1和AOX2都活跃的野生型称为Mut+;AOX1基因丢失,只存在AOX2时,大部分的醇氧化酶活力丧失,这种细胞利用甲醇能力低,在甲醇培养基上生长缓慢的菌株表现型为MutS(Methanol utilization Slow)表型,MutS酵母株具有突变的aox1位点,但AOX2是野生型的;而在两个AOX基因都缺失的菌株称为Mut−。


二、毕赤酵母表达重组蛋白的工具及技术




在利用毕赤酵母进行重组蛋白生产的过程中,成熟且不断扩大的工具和技术在重组蛋白生产过程种发挥重要作用,使得P. pastoris成为一个高效的表达系统(图2)。

图2 P. pastoris生产重组蛋白的的流程



2.1

宿主菌株



目前所使用的各种巴斯德毕赤酵母菌株均来自于原始的Y-11430菌,菌株的选择包括野生型、营养缺陷型、蛋白酶缺陷和糖工程菌株等(表1)。蛋白胞内表达时,可优先考虑用MutS表型,分泌表达时Mut+和MutS都可使用。SMD1168、GS115、KM-71等大部分酵母菌株是组氨酸脱氢酶缺陷型,可利用不含组氨酸的培养基筛选重组子。SMD1168为蛋白酶缺陷型,适用于需要保护表达蛋白质免受内源性蛋白酶降解的情况,如表达不稳定的蛋白质或蛋白质复合物。

表1 常用P. pastoris的宿主菌株


2.2

表达载体


在酵母表达系统中,用于转化的质粒或载体上往往不含有酵母自身的复制源点,如果将环状重组质粒直接转入酵母细胞则不能稳定存在,所以必须进行线性化处理,以同源重组的方式整合到酵母染色体上,目的基因才会在酵母细胞中稳定存在。酵母表达系统的表达载体以整合型载体为主,常见的整合型载体包括胞内蛋白表达和分泌蛋白表达两种类型。胞内表达载体:主要包括pGAPZ、pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2等,将目的基因在胞内表达,可避免酵母的糖基化,适合于在胞浆表达或无糖基化蛋白,较胞外分泌表达水平高但纯化相对复杂。分泌到胞外表达的载体:pPIC9、pHIL-S1p、pPICZα、pYAM75P等。多拷贝插入表达载体:pPIC9K、pPIC3.5K,重组基因的多拷贝整合能够增加蛋白的表达量。

表2 常用的P. pastoris表达载体




2.3

启动子


毕赤酵母提供了多种经过良好表征的组成型和诱导型启动子供选择,组成型启动子提供简单性和相对恒定的表达水平,而当需要分离生长和生产时通常使用诱导型启动子,这能防止生长较快的非重组细胞或产生毒性蛋白(表3)。组成型启动子如pGAP和pGCW14常用于大规模重组蛋白生产,但不适合表达对细胞有毒的蛋白。诱导型启动子如pAOX1为强诱导型启动子,在甲醇存在时强烈激活从而高效驱动目的基因表达,适用于大规模生产;pFLD1可利用甲醇或甲甲胺诱导FLD1表达重组蛋白,甘油或葡萄糖可替代甲醇。甲醇的毒性促使不依赖甲醇的表达系统的广泛研究,如pGTH1在葡萄糖限制条件下诱导,在特定的培养条件下促进细胞的代谢转变,从而提高目标产物的产量;pTHI11在低浓度硫胺素时激活,通过调节硫胺素的浓度来实现基因表达的调控;pADH3在乙醇作为碳源的情况下驱动基因表达。

表3 P. pastoris的启动子



2.4

信号肽及终止子


信号肽帮助将目标蛋白定位到细胞的分泌途径,确保其正确的折叠和后续的修饰,这对功能性蛋白质的高水平表达和分泌至关重要。毕赤酵母中常用的信号肽有酿酒酵母的α交配因子(α-Mating Factor,α-MF)、蔗糖转化酶2(SUC2)、毕赤酵母酸性磷酸酶(PHO1)等,α-MF使用最多,主要用于多肽和小蛋白的分泌表达。研究人员在已报道的毕赤酵母分泌蛋白质组和基因组中发现了4个新的内源信号肽:Dan 4、Gas 1、Msb 2和Fre 2,扩充了可用于毕赤酵母重组蛋白表达和分泌的信号肽库。


终止子区域可影响表达水平,毕赤酵母中的终止子工具箱只包含20个终止子,且表达变化不大。目前有研究开发和表征了一个包含72个内源性、异质性和合成终止子的目录,在其中观察到了17倍的可调性,新的终止子目录提供了更多的选择和调控能力。



2.5

CRISPR/Cas9技术


成熟的分子生物学技术加快了毕赤酵母菌株生成过程。GoldenPiCS是一种模块化克隆工具,技术的核心在于简化克隆和构建重组载体的过程,使多个基因可以在单个载体中快速组装,进而整合到宿主细胞的基因组中。这种方法通过选择性标记和增加选择压力,提升重组基因的拷贝数,从而提高蛋白质产量。


CRISPR/Cas9等新技术的应用实现对P. pastoris基因组的精准编辑,包括基因敲除、插入和替换。通过敲除抑制性基因或增强关键基因的表达,提高P. pastoris中重组蛋白的产量。利用CRISPR/Cas9进行代谢工程改造P. pastoris的代谢通路,从而提高特定代谢产物(如酶或化合物)的产量;还可以实现无标记的基因组整合,避免抗性标记的使用,减少对细胞的潜在负面影响;支持同时靶向多个基因,使得在P. pastoris中进行复杂的基因组编辑和工程变得更加高效。不断优化CRISPR/Cas9在P. pastoris中的应用,包括提高编辑效率、降低脱靶效应等,进一步推动P. pastoris在生物医药、工业酶生产及代谢工程等领域的应用。


三、毕赤酵母在重组蛋白中的应用




毕赤酵母作为重组蛋白生产的宿主,涵盖了生物医药、工业酶和新兴市场的多个领域,显示出其多功能性和适应性。


在生物医药领域,毕赤酵母表达系统被广泛应用于生产各种重组蛋白药物,如抗体、疫苗等。2018年,一款用于治疗成年获得性血栓性血小板减少性紫癜抗体药物Caplacizumab获得了欧盟EMA批准上市,这是首款采用毕赤酵母表达系统生产的纳米抗体药物。2020年2月21日,FDA批准丹麦灵北制药的Eptinezumab上市,是首个毕赤酵母表达的单抗药物。Eptinezumab是一款CGRP人源化IgG1单克隆抗体,通过重组DNA技术在巴斯德毕赤酵母中表达而得,并通过定点突变改变糖基化位点来阻断N-糖基化,解决了特异性高甘露糖链的免疫原性问题。2022年5月,沃森生物研发的全球第一支毕赤酵母表达的二价人乳头瘤病毒疫苗-沃泽惠获得上市许可,沃泽惠使用的毕赤酵母在产能方面比拥有4价和9价疫苗的默沙东公司使用的酿酒酵母表达系统更具优势,且成本更低。2024年8月智飞生物研发的四价重组诺如病毒疫苗(毕赤酵母)进入三期临床,该疫苗是通过基因工程技术在毕赤酵母表达系统中分泌表达诺如病毒蛋白的病毒样颗粒。毕赤酵母有诸多优势,首先毕赤酵母与CHO细胞都是真核细胞,拥有高等真核表达系统的诸多优点;其次,毕赤酵母构建细胞株更快,不需要耗时的病毒清除验证步骤,极大缩短了研发周期;最后,从生产方面而言,毕赤酵母有更快、更容易、更便宜、更高产量的特点,还可以高密度、大规模培养,大幅降低抗体药物的生产成本。至此,毕赤酵母受到越来越多研究机构和医药生产企业的青睐,胰岛素、乙肝表面抗原、人血清白蛋白、表皮生长因子、肿瘤坏死因子等多款蛋白药物相继使用酵母表达系统进行蛋白表达并上市。


在基础研究领域,利用毕赤酵母表达系统表达各种重组蛋白及其突变体,研究蛋白的结构、蛋白之间的相互作用、生物化学特征和生物物理研究等。通过毕赤酵母表达获得了多种青霉素酶的高分辨率晶体结构,这对于了解其催化机制至关重要。在毕赤酵母中表达的GPCRs和其他转运蛋白,极大地增进了对其功能和底物运输机制的理解。毕赤酵母是同位素标记蛋白的首选宿主,适合进行NMR结构分析,研究中使用的各种标记策略(如13C、15N、19F标记)提升了光谱的解析度和敏感性。



结语

毕赤酵母是重组蛋白生产的优选表达平台,具备高效表达系统、高细胞密度生长、高水平重组蛋白生产、多样化的翻译后修饰、简化的纯化过程以及无内毒素和病毒的安全性等优势。毕赤酵母拥有多种组成性和诱导性启动子,能在不同培养条件下精确控制基因表达,从而实现重组蛋白的高效生产。然而,甲醇毒性、蛋白水解和截断、基础研究工具的局限性以及表达水平不足等挑战仍需克服。


CRISPR/Cas9等基因组编辑技术的应用将提高同源重组效率。启动子工程的发展可以开发新的启动子或改进现有启动子,以提高表达水平和调控能力。通过糖基工程,毕赤酵母可以生产具有高度均匀的人类N-链接糖链的重组蛋白,提高其在生物制药应用中的潜力。通过不断的研究和技术创新,毕赤酵母有望在未来解决现有挑战,实现更高效、更安全的重组蛋白生产。


参考文献

[1] De S, Mattanovich D, Ferrer P, Gasser B. Established tools and emerging trends for the production of recombinant proteins and metabolites in Pichia pastoris. Essays Biochem. 2021 Jul 26;65(2):293-307.

[2] Karbalaei M, Rezaee SA, Farsiani H. Pichia pastoris: A highly successful expression system for optimal synthesis of heterologous proteins. J Cell Physiol. 2020 Sep;235(9):5867-5881.

[3] Pan Y, Yang J, Wu J, Yang L, Fang H. Current advances of Pichia pastoris as cell factories for production of recombinant proteins. Front Microbiol. 2022 Nov 24;13:1059777.

[4] Barone GD, Emmerstorfer-Augustin A, Biundo A, Pisano I, Coccetti P, Mapelli V, Camattari A. Industrial Production of Proteins with Pichia pastoris-Komagataella phaffii. Biomolecules. 2023 Feb 26;13(3):441.

[5] Zha J, Liu D, Ren J, Liu Z, Wu X. Advances in Metabolic Engineering of Pichia pastoris Strains as Powerful Cell Factories. J Fungi (Basel). 2023 Oct 19;9(10):1027.

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