瞿介明教授：适用「三大场景」，为实时监测「提速增效」……耐药革兰阴性杆菌感染快速诊断和智能优化治疗策略研究

在感染病学领域，革兰阴性杆菌是引起院内感染的主要病原微生物之一。特别是在肺部感染中，医院获得性肺炎（HAP）和呼吸机相关性肺炎（VAP）主要由革兰阴性杆菌引起，其中耐药革兰阴性杆菌构成了严峻的挑战。比如，传统的抗生素往往治疗效果不佳，导致治疗周期延长和医疗成本增加。世界卫生组织（WHO）在今年5月发布了警惕耐药高毒力肺炎克雷伯菌正在全球蔓延的重要公告。因此，制定一套针对耐药革兰阴性杆菌感染，尤其是肺部感染的快速诊断和智能优化治疗策略显得至关重要，这也是未被满足的临床需求。

这是2024年发表在《柳叶刀》上的统计数据，可以观察到，全球因耐药性或直接耐药性细菌感染导致的死亡人数：2021年估计有471万人的死亡与细菌耐药性有关，其中114万例的死亡归因于细菌耐药性。抗生素耐药性已成为全球第三大致死因素，仅次于心脏病和中风。[1]

目前已观察到的病原微生物中，与抗微生物药物耐药性（AMR）相关的致死性病原体，前五位主要包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和肺炎链球菌。[1]特别是肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和鲍曼不动杆菌就占据三位，由此，更加凸显了优化治疗革兰阴性杆菌引起的肺部感染的重要性。

当前的关键科学问题是什么？比如在申报国家自然科学基金、国家2030重大慢病项目的过程中需明确，申报项目成功的核心在于明确掌握或深刻理解关键的科学问题与亟待解决的科学难题。唯有准确回答这两个问题，方能确保项目申请书在重点、要点以及逻辑的侧重点上的精准定位，进而显著提高获批的概率。

深感荣幸，我们先前成功获得了一项中英国际合作的国家重点研发项目。我们所面临的一个重大关键科学问题，同样也反映出当前临床与科研领域的现状：

从标本采集、培养、染色，到细菌鉴定和药敏测试，通常需要5-6天才能获得最终体外药敏的结果，即使在最乐观的情况下，也至少需要约48小时。这就意味着，对于由革兰阴性杆菌引起的重症肺部感染，如果经验性治疗方案未能全面覆盖该病原体，患者将面临极大的预后不良的风险。当经验性治疗未能覆盖相应的病原体时，即不恰当的治疗，可能导致病死率显著上升，这正是我们目前在临床实践中所面临的严峻挑战。

临床实践中迫切需要对病原微生物进行精准且全面的诊断。如何应对和解决这些未被满足的临床需求？值得庆幸的是，近年来病原微生物核酸诊断技术的迅猛发展，为实现快速且精准的诊断提供了有力支持。

例如，二代宏基因组测序技术的发展使我们能够更加快速和准确地识别病原体，从而为临床治疗提供科学依据。通过二代测序技术，我们能够在24小时内完成病原体的鉴定，显著缩短了传统培养方法所需的时间。此外，二代测序技术还能够检测包括难以培养的微生物在内的多种病原体，这对于复杂感染的诊断尤为重要。然而，二代测序技术也存在一些局限性，比如在提供抗生素药敏分析方面受到覆盖度和深度的限制，而病原菌的药敏分析在临床治疗中至关重要。因此，三代靶向病原宏基因组测序体系应运而生，它结合了二代测序的高通量和靶向测序的深度，有助于同时提供病原体鉴定和耐药性分析的结果，为临床提供更为全面的诊断信息。

那么，在重症肺部感染，特别是革兰阴性杆菌感染的治疗中，如何实现更精确、更智能化的抗感染药物调整呢？这同样是一个未被满足的临床需求。

众所周知，重症或危重症患者的心肺功能、肾功能以及表观分布容积都会发生变化，导致药物分布与非重症患者存在显著差异。因此，在治疗过程中需要对药物浓度进行实时监测。为此我们进一步研发了TDM床边实时监测技术，为抗菌药物的优化治疗奠定了基础。这些工作成为了推动医疗进步的重要力量。

关于病原菌的快速诊断，我们团队主要致力于两个核心方向的工作：一是病原菌耐药数据库和生物信息分析平台的建立；二是快速分子生物学诊断和宏基因组测序技术的开发、应用和推广。

首先，我们建立了覆盖二十多种临床常见病原菌的耐药数据库，简称ARPBdb。

从中可以看到，ARPBdb列出了从公共数据库收录的6265株病原菌全基因组序列的耐药移动元件分析结果。此外，本地数据包含了收集自合作单位的近700株病原菌，现在已经达到了1600株临床分离株及其基因组序列，覆盖二十多种病原菌。[2]

该数据库的优势从几个方面体现。第一个方面：1、为LAMP、数字PCR引物设计提供高质量参考基因组；2、有助于开展耐药细菌流行病学分析及病原体溯源研究。

换言之，我们整合了本地数据与公共数据库，构建了一个涵盖临床常见病原菌耐药性的综合数据库。该数据库是开放性的，任何研究者若需对比特定病原微生物，均可利用我们的数据库进行查询。这些数据不仅适用于临床流行病学分析，包括病原追踪研究，更为重要的是，它们为我们的新型快速核酸诊断技术提供了宝贵的基因组参考。[2]

第二个方面，利用该数据库，我们开发了一个名为VRprofile2的耐药菌生物信息分析平台。该平台能通过一键式操作，快速识别耐药菌的可移动元件、毒力基因和耐药基因等关键要素。

在耐药革兰阴性杆菌或其他细菌中，耐药和毒力是研究者们极为关注的焦点。对应的毒力和耐药一般都有相应的基因所介导。因此，在这种一键式快速识别的基础上，我们构建了「菌型-质粒-耐药基因」的有效关联，以辅助分析宏基因组二代测序数据，相关研究已在生物信息学、数据库和核酸研究顶级刊物《Nucleic Acids Research》上发表。同时，该平台也为耐药革兰阴性杆菌的生物信息分析和海量临床菌株基因组序列分析提供了免费且开放的技术平台，为细菌基因调控、质粒转移等分子遗传学实验提供了必要的分析工具。[3-8]

事实上，该生物信息分析平台为我们一系列的耐药和毒力的研究提供了支撑，包括我们团队发表的一系列高质量的研究成果，例如在Genome Medicine连续发表了两篇关于兼具高耐药和高毒力肺炎克雷伯菌的研究，揭示了高毒力与高耐药并存现象的分子遗传学机制。这些研究也是在国际上首次系统性地阐释了该现象背后的质粒诱动转移机制，从而也凸显了生物信息分析平台在这一领域研究中发挥的重要作用。[3-8]

第三个方面，如何构建一套快速诊断技术？首先，我们研发了基于环介导等温扩增技术（LAMP）实现在45分钟内快速检测病原菌及其耐药基因的诊断体系。该技术由我们团队与英国萨里大学团队共同开发、研究、建立。我们首先进行了肺炎克雷伯菌的研究，从公共数据库里将肺炎克雷伯菌的基因组和非肺炎克雷伯菌的基因组进行对照，选择了3个候选基因作为肺炎克雷伯菌种属特异性基因的序列。针对3个候选基因组设计了6对引物用于环介导等温扩增。[9-10]

可以看到，如果检测的样本为纯化的细菌病原菌，其检测敏感性和特异性均超过95%。如果用痰液直接检测肺炎克雷伯菌及其耐药基因，敏感性和特异性也可达到90%及以上，可满足临床需要。[9-10]

我们还在LAMP技术的基础之上继续开发出相应的诊断试剂盒——「冻干型-恒温显色法肺炎克雷伯菌LAMP检测试剂盒」。[9-10]

但是，假如需要同时检测十种或几十种病原微生物，尤其是对于重症感染患者，例如肺部感染合并脓毒血症时，需要对血液进行微生物检测时，环介导等温扩增技术（LAMP）也许不能够满足临床需要。

因此，第四个方面，我们开发了液滴式数字PCR技术（ddPCR）辅助脓毒症病原菌快速精准诊断，该技术能够在2.5小时到3小时之内，针对肺部感染合并脓毒血症的12种院内常见致病菌及其3种关键耐药基因进行快速检测。该技术很好地解决了重症感染包括脓毒血症、肺部感染时多种病原体快速检测的要求。相关研究也发表在国际权威杂志Crit Care上。[11]

尽管如此，我们仍观察到在有些场景之下，前述的几项技术也未必能完全满足临床需要。那么，如何才能更有效地提高病原覆盖度和检测效率？为此，我们对二代和三代宏基因组测序技术进行了深入的系统研发。

二代宏基因组测序技术主要用于免疫抑制患者的感染诊断，如肿瘤放化疗患者、器官移植患者等；也可用于痰液和支气管肺泡灌洗液标本的联合检测，12小时至16小时即可完成。三代宏基因组测序技术可进一步缩短时间至6-12小时。总体而言，对于免疫抑制宿主的患者，或其他需要扩大病原微生物覆盖度的情形，可以采用二代和三代宏基因组测序技术满足临床需要。

我们的研究项目对快速诊断技术进行了系统研究，全面覆盖了三大场景。首先是LAMP技术，该技术能在45分钟内完成检测，主要用于快速筛查，特别适用于院内感染中革兰阴性杆菌的快速筛查；对于重症肺部感染、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、脓毒血症和血流感染等紧急情况，可以采用ddPCR技术，该技术能够在3小时内提供快速诊断结果；针对免疫缺陷患者出现的肺部感染，使用二代宏基因组测序体系和三代靶向病原宏基因组测序体系，这两种技术分别能够在12-24小时和6-12小时内完成快速检测。目前，二代和三代宏基因组测序体系已经在多家合作医院进行了研究和推广。对于医院获得性感染患者，以上三种诊断技术基本上能够满足临床上快速、精准的病原微生物诊断需求。[12-13]

面对重症的革兰阴性杆菌引发的肺部感染时，如何实现对血药浓度的实时监测？目前血药浓度监测尚未广泛普及，其原因在于该检测项目需要汇集多个患者的样本进行集中分析，以避免单独进行高压液相色谱检测时资源的大量浪费。在医院里，我们通常会等待临床标本累积到一定数量后才进行血药浓度的高压液相检测，检测结果可能需要数天才能获得。在这种情况下，患者的病情可能已经严重恶化，而我们分析的样本却是几天前的，具有滞后性。

如何解决这一问题？一方面，我们的中英合作研究团队共同开发了一种分子印迹聚合物电化学传感器，专门针对头孢他啶阿维巴坦这种药物。鉴于这种药物在治疗革兰阴性杆菌感染、重症肺部感染以及脓毒血症方面应用广泛，我们首先对它进行了系统性的研发工作。

我们开发了一种抗生素联合用药电化学传感器制备方法及传感方法，并获得一项国家发明专利的授权。这种分子印迹法实现了血药浓度的快速监测，目前已经在危重症患者中进行了有效的临床应用。[14]

相较于传统的高压液相色谱法，这种新型技术实现了几乎完美的吻合率，并能够在1小时内完成床旁治疗药物监测（TDM），其检测结果与高效液相色谱法相当。尽管目前使用的检测设备体积较大，但未来我们有望将这些设备缩小为便携式手提检测器。这样一来，对于重症患者而言，过去难以实现的床旁实时血药浓度监测将变得可行。便携式实时监测设备将发挥重要作用，特别是在处理医院获得性革兰阴性杆菌感染、肺部感染和脓毒血症等重症感染情况下。拥有这些第一手数据资料，医生能够及时掌握重症患者的血药浓度是否达到了治疗目标。

第二个方面是构建针对脓毒症患者的优化的美罗培南群体药动学模型。传统治疗重症肺部感染并发脓毒血症时，例如使用美罗培南，个体的PK/PD（药代动力学/药效学）分析是常见的做法。通常，我们会直接测量患者的血药浓度，并据此计算出其在不同时间点的血药浓度，以评估药代动力学和药效学特性。然而，这种方法并不充分。对于危重症患者，我们应当采取动态监测，分析危重症患者应用美罗培南后PK/PD达靶标情况。基于此，我们的研究团队开发并建立了群体药动学（PPK）模型。结果显示使用Cockcroft-Gault公式估算肌酐清除率（CLCR-CG）和肾功能亢进是美罗培南清除率的显著协变量，体重指数和腹腔感染性休克是分布容积的显著协变量。

在建模完成后，我们对外部数据和临床数据进行了验证，结果表明，该模型的相关系数极高，尤其是在有效区间内展现了良好的匹配能力。我们可以观察到，浓度相关的吻合率同样非常出色。因此，对于美罗培南而言，我们所建立并验证的PPK（群体药动学）新模型得到了充分的证实。

在PPK模型的指导下，我们运用蒙特卡罗达标概率模拟分析，精确指导了美罗培南的给药剂量和给药间隔。通过这项分析，我们成功确定了在不同肌酐清除率和病原菌最小抑菌浓度（MIC）条件下的美罗培南概率目标达成率（PTA）预测值及剂量推荐方案。简而言之，通过患者的肌酐清除率和病原微生物的MIC值这两个关键数据，我们能够准确预测美罗培南的PTA值和推荐剂量。因此，在治疗策略上，我们摒弃了传统的给药方案，例如以往常见的每6小时或每4小时给药一次，每次1-2克的粗略剂量范围。现在，我们会根据个体的肌酐清除率和MIC值，提供定制化的推荐治疗方案。关于这项研究，我们已经获得相应的软件著作权。

人工智能(artificial intelligence，AI)技术，现在越来越多地被用于医疗决策系统中，为了更好地预测危重症患者感染的发生，我们团队采用AI开发构建了危重症感染常见革兰阴性菌感染预测软件系统。采集感染相关的时序数据用于预测模型训练，包括患者入住ICU时的状况、抗感染治疗过程、预后状况评估，还包括患者的人口统计学信息（如年龄、性别和种族）、临床指标（如体温、血压、心率等）、实验室检查结果以及肺部的影像学检查等。

我们根据医生经验和数据科学家分析的结果来确定这些数据的收集范围和方式。利用人工智能算法对采集到的临床数据进行预处理，包括数据清洗、标注、特征提取等，将数据规范化为结构化数据，以便于构建模型并进一步预测分析。我们选择高斯模型作为分类模型，神经网络预测模型（RNN）作为预测模型，采用Q-learning机器强化学习算法辅助治疗决策模型。

建模之后，我们构建了一个革兰阴性杆菌危重症患者感染的预测软件，并获得了两项软件著作权。换言之，将临床数据输入到Q-learning的模型当中，即可反馈该患者发展成为重症革兰阴性杆菌感染的可能性。

可见，用于危重症感染患者的常见革兰阴性菌感染预测软件系统，将人工智能和大数据技术应用于肺部健康管理领域，该系统旨在通过对危重症患者临床数据的实时分析，预测临床常见的革兰阴性菌感染风险，为用户提供了一种精准、便捷的肺部健康预测和管理服务。该方案亦具有数据精准、快捷方便、个性化服务和专家支持等核心优势，可广泛应用于临床辅助诊断、健康管理、科研机构研究和体检中心等应用场景中。

基于肺炎克雷伯菌基因组数据预测美罗培南的最低抑制浓度，也是我们其中一项研究工作。

世界卫生组织（WHO）将碳青霉烯耐药、第三代头孢菌素耐药的肺炎克雷伯菌的优先等级列为「关键」级别。鉴于肺炎克雷伯菌如此高的公共卫生关注度，我们是否能够根据肺炎克雷伯菌的基因组，尤其是耐药基因组，来预测美罗培南的最低抑制浓度（MIC）呢？

我们团队将肺炎克雷伯菌宏基因组测序数据预处理为k-mers和SNPs表，并结合美罗培南MIC值，构建了一个高效的预测模型。该模型能够在24小时内快速预测MIC值。相比之下，传统方法从体外培养到获得MIC值，通常需要大约3天时间。我们的研究显示，无论是单纯使用k-mer数据还是联合使用SNP数据，该模型的预测准确率均超过了91%。这一利用基因序列信息预测药物最小抑菌浓度的创新方法获得了国家授权发明专利。该方法有效地利用了大数据进行精准建模，为快速预测MIC值提供了新的研究思路和技术方法。

这是一篇已经正式发表的研究成果，基于临床样本宏基因组测序数据，我们成功构建了一个耐药表型预测模型。该模型的开发初衷在于探究我们是否能够通过基因组检测和分析，来预测痰液、尿液、胸腔积液和腹水等临床标本中病原菌的耐药性。在本项研究中，我们对临床样本进行了高通量测序，并运用人工智能技术，将肺炎克雷伯菌对于常见抗生素的耐药表型进行了建模。从上表中可见，经过近200个临床样本的验证结果显示，其预测准确率超过88%，并且整个过程能够在20小时内完成。这项研究发表于国际权威的临床微生物学期刊《International Journal of Antimicrobial Agents》上。

可以预见，当我们获得临床标本，无需经过漫长的传统培养步骤，而是直接进行高通量的检测，在短短20小时之内，临床医生即可收到反馈的报告，明确指出患者携带的病原微生物种类，以及这些病原菌对哪些抗生素药物表现出耐药性。这一进展显著缩短了经验性抗生素治疗的时间，为精准治疗提供了强有力的支持和重要保障。通过这种方式，医生能够根据病原体的耐药性信息，迅速调整抗生素治疗方案，从而提高治疗效率，减少不必要的药物使用，降低患者的医疗费用。更为重要的是，这种方法使得医生可以根据耐药表型选择更为合适的抗生素，避免了广泛使用广谱抗生素导致的耐药性问题，减少耐药菌株的产生。随着该技术的进一步发展和应用，未来我们有望在更多临床场景中实现快速、准确的病原体耐药性检测，为患者提供更加个性化和高效的治疗方案。

关于未来的展望，我想分享一些个人见解。未来，值得我们深入探讨的首先是快速诊断技术的发展。目前，国内大多数医院的快速诊断技术还处于实验室研发阶段，或者刚刚开始使用诊断试剂盒。那么，我们应该如何推动这些新技术的发展呢？这涉及到实验室开发测试（LDT）以及研究者发起的诊断试剂盒开发项目，包括但不限于病原微生物的快速检测和血药浓度的快速测定。这些技术的发展应该朝着便捷化、实用化和可及化的目标迈进。因此，我认为这是我们整体发展的方向。

上海瑞金医院和其他四家医院目前已经被确定为实验室研发检测（LDT）的试点单位。国内同行若拥有创新的检测技术，可通过此途径向国家申请成为LDT试点单位。一旦相关技术完成备案流程，便能够正式投入临床应用，从而为患者带来实质性的益处。这些检测服务是允许收费的项目，若不收费则视为非法。因此，从这一视角出发，包括医保在内的支付体系也可以覆盖这些服务项目。据我所掌握的信息，北京、上海、广州等大城市的主要公立医院正在开展此类试点项目，这也预示着未来医疗的发展趋势。我们也将鼓励开发更加便捷、实用且易于获取的诊断方法。

基于本项目的研究工作，我特别绘制了一幅示意图，旨在推荐危重感染的快速诊断和优化治疗的临床路径。具体而言，对于重症革兰阴性杆菌感染的情况，如何实现快速诊断和治疗优化呢？实际上，这涉及两个主要环路：首先，我们采用预警预测软件。在患者到达医院后，我们将收集其所有相关信息，尤其是重要的参数，然后利用该软件预测患者是否有发展为重症的可能性。

在病原微生物检测领域，如前所述，根据不同的应用场景，我们可以选择不同的检测方法。这些方法包括能在45分钟内完成的LAMP检测技术、3小时内得出结果的ddPCR技术，以及需要12至24小时完成的宏基因组测序技术。此外，我们还开发了新型快速诊断技术，这些技术能够检测病原微生物的种属、耐药基因、毒力基因等信息，并有效关联至特定病原菌。通过应用人工智能技术进行病原微生物的耐药表型和最小抑菌浓度（MIC）的预测，从而优化抗菌药物的选择，实现更为精确的治疗方案。

与此同时，我们也在持续关注病原学诊断的另一个重要方面，即宿主及其相关脏器的功能，例如肾功能、肝功能。通过建立群体药动学模型，并进行实时血药浓度监测，我们能够更精确地调整药物剂量和给药间隔，从而优化抗菌药物的剂量。这一方法有助于实现更为精准的抗感染治疗。因此，我绘制的这幅示意图不仅概括了我们对革兰阴性杆菌肺部感染和其他重症感染的快速诊断，也体现了我们如何通过综合考虑病原学和宿主因素，实现治疗策略的优化。

最后，我要向所有参与本项目的合作团队表达深深的谢意，感谢各位同仁为本项目做出的宝贵贡献。

* 文章仅供医疗卫生相关从业者阅读参考

本文完

责编：Jerry

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