微生物大样本研究涉及环境、水产、畜牧等多个领域，是近年发表高分文章的热点内容。除了可以回答微生物物种组成这些传统问题之外，大样本分析还可以更好地揭示微生物与外界条件的关系问题。16S/ITS作为最基础的微生物研究手段，结合大样本分析是高分文章的应用趋势。在之前的推送中，我们针对样品分组数较少的情况给大家总结了大样本微生物组4大分析模块等研究思路。然而在实际研究中，我们的实验设计一般会从时间、空间等角度设置多个梯度来揭示微生物群落变化规律，那么在分组多的情况下，我们该如何做呢？具体分析思路如下：![]()
今天分享两篇基迪奥客户文章，让我们一起看看在分组多的情况下，如何利用各分析点形成更好的研究思路~文章题目：Land-use intensification exerts a greater influence on soil microbial communities than seasonal variations in the Taihu Lake region, China发表期刊：Science of The Total Environment（IF：8.2）研究目的：调查了土地利用集约化和季节变化对土壤细菌和真菌群落多样性、组装过程、共现网络和代谢功能群的影响，为土地利用集约化如何影响湿地生态系统功能提供了有价值的观点。文章题目：Deciphering assembly processes, network complexity and stability of potential pathogenic communities in two anthropogenic coastal regions of a highly urbanized estuary发表期刊：Environmental Pollution（IF：8.3）研究目的：比较分析两个区域的潜在病原体群落的生物地理模式、驱动因素、组装机制以及复杂性和稳定性，进一步指导沿海生态系统潜在致病群落的影响机制和组装的研究。判断分组是否合理，一般从两个层面来看，一是宏观层面，通过Alpha多样性与Beta多样性分析从群落水平来检验整体的分组是否有效，或者进一步筛选可以进行两两比较的分组；二是微观层面，通过多组间差异分析（如统计检验、富集三元图等）判断取样分组的微生物是否存在显著差异，寻找差异物种信息。例如在宏观层面上，案例一利用Alpha多样性与Beta多样性分析发现在时间尺度上土地利用集约化和季节性变化显著影响了土壤细菌和真菌群落的多样性和组成；在微观层面上，案例一和二都通过统计检验进行差异分析，发现时间和空间变化均导致微生物群落之间存在显著差异的物种，如EPR和NSE中差异致病菌属有Prevotella_9、Legionella、Candidatus_Renichlamydia、Vibrio。以上结果均可以初步判断该研究的实验分组设计是合理的。微生物群落结构变化的原因一般是生物或非生物因素导致的。从非生物因素的角度，我们可以通过环境因子分析来评估环境因素和微生物群落之间的相互关系，进一步挖掘驱动微生物群落变化的关键因素。具体来说，可以通过Mantel检验、CCA/RDA分析、VPA分析等方法从整体探索群落物种组成是否与环境相关，或者定量分析指定环境因子对微生物群落变化影响的解释度，还可以利用相关性热图和网络图分析目标物种与环境因子之间的相关性。例如案例一和二都使用VPA分析查看环境因素对微生物群落的解释度，发现环境因素对真菌群落结构的解释力大大低于在细菌上观察到的解释力，而潜在致病群落变化则由环境和空间变量的相互作用来解释，因此我们下一步重点关注案例一的细菌群落与案例二的环境和空间变量。同时通过Mantel检验、CCA/RDA分析以及结构方程模型等方法分析得到，案例一中NO3--N、pH、EC等土壤理化因子是细菌群落结构的关键驱动因素；而案例二中EPR群落的驱动因素只有N-NH4+，NSE群落的影响因素有T、DO、Sal、营养因素。那么在这一步我们解释了导致上述微生物群落结构变化的具体原因，为下一步挖掘群体信息做铺垫。根据前两步的分析结果，我们可以得出微生物群落结构在时间和空间上存在显著变化，并且发生变化的原因与环境因素显著相关。我们知道微生物群落的结构组成往往与群落的功能密切相关，微生物群落结构的稳定性在一定程度上影响功能是否能在特定环境条件下稳定发挥，因此我们通常会关注微生物群落在应对外界干扰或不利条件时，其群落组装过程和稳定性是否会受到影响。群落构建模型（包括零模型的群落构建机制（iCAMP）、标准化随机性比率（NST）、Sloan中性模型（NCM）等）可以通过评估随机性和确定性过程在微生物群落组装的相对重要性，进而分析外界因素是如何影响微生物群落组装过程的。在图6中我们发现，土地利用集约化减少了细菌确定性过程，在真菌群落中呈相反趋势；而EPR和NSE中潜在致病群落的组装主要由随机过程（主要为非主导过程和扩散限制）驱动的，同时确定性过程（尤其是异质性选择）也起到重要作用。在这一步，我们可以揭示时间和空间变化是如何对微生物群落结构产生影响的。
在自然环境中，物种之间并非独立存在的，而是存在着千丝万缕的联系。我们可以通过物种与物种之间或者物种与环境之间的相关性分析，了解微生物间关联模式变化，进而分析微生物群落结构的稳定性。例如案例一通过物种与物种之间的共现网络分析，发现土地利用集约化对土壤细菌群落共现网络复杂性有明显影响，对真菌影响不大。案例二则通过分析不同物种模块与环境因子之间的相关性，发现EPR中潜在致病群落的复杂性和稳定性高于NSE，这意味着EPR中的潜在致病群落对扰动的抵抗力更强。微生物相互关系的复杂性与生态系统的稳定性之间存在强大的相关性，在这一步我们可以推测微生物群落能否更好地应对外部干扰或不利条件，为下一步研究微生物群落的功能做铺垫。
从这两篇基迪奥客户文章不难看出，他们的样本量大且分组数较多，所以他们选择的研究思路都是先对实验预先假设的分组进行验证，分析得到微生物群落结构变化的关键驱动因素，再进一步挖掘微生物群落的群体信息，通过分析环境因素对微生物群落组装过程和稳定性的影响，逐步揭示微生物群落在特定环境中的适应机制。下一步我们还可以通过联合多组学进行分析，在功能信息拓展、代谢通路验证等方面对微生物群落进行深入研究，为实现微生物组的应用做铺垫。不知道今天的内容是否对小伙伴们接下来的研究工作有所启发呢？欢迎大家在留言区评论交流鸭~*未经许可，不得以任何方式复制或抄袭本篇文章之部分或全部内容。版权所有，侵权必究。
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