蛋白质是细胞内执行绝大多数生物功能的直接分子，因此蛋白质组学能够直接反映细胞当前的状态和活动。如果说转录组研究是在告诉我们可能发生了什么，那蛋白质组学则展示了实际正在发生的事情。√ 基因组学：基因组学研究DNA序列，它提供了生物体的遗传蓝图，但并不直接反映蛋白质的表达水平和功能状态。基因表达调控复杂，不是所有基因都翻译成蛋白质，且一个基因可产生多个蛋白质变体。√ 转录组学：转录组学关注mRNA水平的变化，是基因表达的一个中间步骤。然而，mRNA水平并不总是与蛋白质水平完全对应，因为存在转录后调控和翻译调控。
√ 代谢组学：代谢组学研究代谢物，它是细胞活动的最终产物。代谢组学可以提供细胞状态的快照，但无法直接揭示产生这些代谢物的蛋白质。
在PubMed搜索“Proteomics”相关的文献，可以看到，自1992年来，蛋白质组学的研究呈现逐年上升的趋势。近几年，蛋白组以每年一万多篇的速度发表着。对这些文献的研究领域热度进行识别，可以看到它们涵盖了微生物、植物、医学等诸多领域，随着技术的进步，蛋白质组学在理解疾病机制、发现生物标志物、开发新疗法等方面显示出巨大的潜力，成为推动精准医疗和个性化治疗的关键工具。要做蛋白质组，首先要选择合适的蛋白质谱技术，在之前的推文当中，我们也多次介绍过目前市面上常见的蛋白质谱技术的原理（蛋白质谱定量技术又成长了——TMT pro；蛋白质谱定量技术又成长了——Direct DIA），随着技术的不断改善，dDIA（direct Data-independent acquisition），与传统DIA分析策略相比，无需进行DDA分级建库，利用机器深度学习，实现直接通过搜索DIA原始文件谱图生成库，鉴定到的蛋白数目与传统DIA的差距也越来越小，在处理复杂样品和大规模蛋白质组学实验中凸显出显著优势。得到数据后，我们要做的下游数据处理都是大同小异的。这个流程图展示了蛋白质组的常见分析流程：接下来这个系列的微信文章，我们就讲围绕蛋白质组的这些分析方法进行逐一讲解。今天这篇文章就先开个头，讲讲蛋白质组数据处理的第一步：蛋白质鉴定（定性）。蛋白质鉴定（定性）是蛋白质组学研究的核心内容之一，其中，数据库搜库是蛋白质组学中用于鉴定肽段和蛋白质的关键步骤。通过将质谱实验中获得的肽段质谱图与理论质谱图进行比对，可以确定肽段的序列，进而推断出蛋白质的身份。首先，使用质谱仪对样品进行分析，生成原始谱图数据文件。同时，选择合适的蛋白质序列数据库，如Uniprot或NCBI，该数据库应包含目标物种的所有已知蛋白质序列，以供后续比对使用。接下来，对原始数据进行去噪、峰检测和峰匹配，以提高数据质量和识别潜在的肽段离子。此外，如果实验中使用了iRT标准肽段，还需进行保留时间校正，确保肽段的保留时间一致性，提高数据的可靠性和可比性。在基于质谱的蛋白质组学研究中，肽段的保留时间（Retention Time, RT）是鉴定和定量的关键参数之一。然而，由于仪器的不稳定性和实验条件的变化，RT会发生漂移，这将严重影响数据的一致性和准确性。为了解决这一问题，iRT（Internal Retention Time Standard）质控被引入到实验中，通过校正RT偏移来提高数据的可靠性。原理：iRT标准肽段是一组已知保留时间的标准肽段，它们在每次实验中与样品肽段一同分析。这些标准肽段的RT在不同实验中保持恒定，可以用来校正样品肽段的RT偏移。通过将样品肽段的RT与标准肽段的RT进行比较，可以计算出校正因子，从而校正样品肽段的RT。根据蛋白质序列数据库生成所有可能的肽段序列及其理论碎片离子，然后将质谱仪采集的实验谱图与这些理论谱图进行比对。通过打分函数评估匹配的质量，并使用FDR（False Discovery Rate）控制，通过引入反向数据库来减少假阳性结果，确保鉴定的可靠性。将鉴定出的肽段归属于相应的蛋白质，形成蛋白质组。再次进行FDR控制，确保蛋白质鉴定的可靠性。Mascot 是一款经典的蛋白质鉴定软件，被广泛应用于质谱数据的检索和分析。它支持多种检索算法，包括肽指纹图谱（PMF）、串联质谱检索（MS/MS Ion Search）和序列查询（Sequence Query），能够处理来自不同质谱仪的数据。Mascot 的核心优势在于其特有的基于随机匹配概率的打分方法，支持标准统计显著性检验和FDR阈值选项，确保鉴定结果的高可靠性。MaxQuant 是一款免费且功能强大的蛋白质组学分析软件，它内置了自己的肽段搜索引擎Andromeda，支持多种质谱数据格式，包括标记定量和非标定量。它的主要优势在于其非线性质量校正和Match Between Runs功能，这些功能显著提高了蛋白质鉴定的数量和定量的准确性。此外，MaxQuant 支持DIA数据的分析，使其成为处理复杂蛋白质组学数据的强大工具。Spectronaut 是一款专门用于DIA数据分析的软件，支持多种质谱仪生成的数据文件格式，并且内置了iRT校正功能，能够自动校正保留时间偏移，提高数据的一致性和准确性。Spectronaut 的主要优势在于其高效的肽段鉴定和蛋白质组装算法，能够处理大规模样本的数据，提供详细的质控报告和统计分析结果。Spectronaut在dDIA模式下无需依赖DDA建库，可以直接从DIA原始数据中提取和匹配谱图，简化了实验流程，提高了分析的效率和准确性。它适用于高通量的蛋白质组学研究，能够处理大量数据，提供可靠的结果。蛋白质组学中的蛋白质定性（鉴定）可以说是进行蛋白质组分析的第一步，也是必不可少的一部，它涉及从数据校正、搜库以及数据质控等多个环节。iRT质控通过校正保留时间偏移，确保数据的一致性和准确性；数据库搜库通过比对实验数据与理论数据，确定肽段和蛋白质的序列；数据质控通过多方面的质量控制措施，确保实验结果的可靠性。常用的软件工具如Mascot、MaxQuant、Spectronaut等为蛋白质组学研究提供了强大的技术支持，使得我们能够更高效地进行数据处理和分析。[1] Mehta D, Scandola S, Uhrig R G. Direct data-independent acquisition (direct DIA) enables substantially improved label-free quantitative proteomics in Arabidopsis[J]. bioRxiv, 2020.[2] Kim, Y. J., Chambers, A. G., Cecchi, F., & Hembrough, T. (2018). Targeted data-independent acquisition for mass spectrometric detection of RAS mutations in formalinfixed, paraffin-embedded tumor biopsies. Journal of Proteomics, 189, 91–96.*未经许可，不得以任何方式复制或抄袭本篇文章之部分或全部内容。版权所有，侵权必究。
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