在翻译组的三大研究方向上，我们已助力客户不断攀登高分！平均IF稳定在13+！在非编码RNA的编码能力分析方向，我们已有过许多成功的研究案例。其中，同一客户6年连发12篇非编码文章，平均IF高达23+！这次，我们的客户再次带来惊喜！来自中国药科大学的合作客户在“非编码RNA编码能力分析”方向，利用转录组+翻译组的联合，一步法成功找到可翻译的目标circRNA，为后续的机制探究以及治疗靶点验证实验确定了正确的方向。接下来，小编对这篇文章的研究思路进行了梳理，让我们一起来学习下吧~环状RNA编码的小肽通过调节STAT1的SUMO化与磷酸化的平衡来阻断免疫原性铁死亡免疫检查点阻断(ICB)疗法是目前黑色素瘤的主要治疗方法，但其临床响应率仍然较低，需要寻找新的治疗策略。而CircRNAs往往在ICB治疗的癌症中持续高表达，这些CircRNA可以影响肿瘤免疫微环境，并且与肿瘤免疫治疗的疗效相关。结合RNA-seq、Ribo-seq和质谱技术，探索影响黑色素瘤ICB疗效的因素，并找到可能的circRNA治疗靶点。经过PD-1抑制剂治疗和脂质体药物与PD-1联合抑制剂治疗小鼠的黑色素瘤肿瘤组织1.基于RNA-seq和Ribo-seq寻找目标circRNA为找到在ICB治疗中持续高表达的CircRNAs，作者对单独使用PD-1抑制剂和与脂质体药物联合治疗的小鼠黑色素瘤组织进行了RNA-seq和Ribo-seq，通过差异分析，作者筛选出了17个在单独治疗中上调，而在联合治疗中下调的CircRNA(图1a)。接着，作者使用IRESfinder软件评估了这17个circRNAs的内部核糖体进入位点(IRES)区域活性，并联合差异分析(图1b)发现，与单一治疗相比，联合治疗后circPIAS1表达下调，表明其可能是促进黑色素瘤生长和阻碍免疫药物的有效性的关键circRNA。（基于Ribo-seq来鉴定circRNA的方法可见文末的总结处）图1 a.通过RNA-seq和Ribo-seq筛选到17个候选circRNA；b.使用IRES评分和差异指数进一步鉴定高蛋白编码潜力的circRNA作者通过分析circRNA的序列特征，发现其来源于PIAS1基因的外显子3-6，且小鼠和人的circPIAS1有94.71%的序列保守性(图1c-d)。此外，通过gDNA和cDNA的PCR扩增，证实了circPIAS1在人和小鼠黑色素瘤细胞中确实存在。通过RNaseR耐受性实验，进一步确认了circPIAS1的环状结构。通过FISH实验，发现circPIAS1主要定位于细胞核内，且与正常组织相比，黑色素瘤组织中circPIAS1的表达水平显著升高。通过circPrimer2.0数据库预测，作者发现circPIAS1可能编码一个108aa长度的多肽circPIAS1-108aa（图2a）。通过双荧光素酶报告实验，作者确定了小鼠和人circPIAS1的IRES序列分别位于81-254bp和21-194bp处，且通过截断IRES序列，发现主要活性区域集中在后半部分。最后，通过LC-MS/MS检测，作者成功鉴定了circPIAS1-108aa的多肽片段，包括其特异的尾部序列，确定了circPIAS1在黑色素瘤细胞中的编码能力。此外，作者还评估了circPIAS1过表达和敲低对circPIAS1-108aa表达水平的影响，结果显示circPIAS1过表达可显著增加circPIAS1-108aa的表达，而敲低则相反。这些结果表明，circPIAS1确实存在与黑色素瘤细胞中且能编码一个108aa长度的多肽。图2 a.数据库预测circPIAS1可编码的108aa长度多肽circPIAS1-108aa；B.通过LC-MS/MS鉴定了circPIAS1-108aa的多个肽片段（包括特异尾部序列）首先通过CCK-8和EdU等一系列实验检测过表达circPIAS1对黑色素瘤细胞增殖的影响，结果发现circPIAS1的促癌作用依赖于其编码的108aa肽，circPIAS1-108aa蛋白水平的升高显著促进了黑色素瘤细胞的增殖。进一步的circPIAS1体内敲低和过表达实验发现，CircPIAS1-108aa可通过抑制STAT1磷酸化来激活SLC7A11/GPX4信号通路，从而促进肿瘤生长和逃避免疫治疗。图3.CircPIAS1-108aa通过抑制P-STAT1/SLC7A11/GPX4信号通路保护黑色素瘤免受铁死亡。5.CircPIAS1-108aa降低ICB治疗的有效性的机制研究表明，用ICB治疗后，活化的CD8T细胞会产生高水平的IFNγ进而促进STAT1磷酸化，抑制SLC7A11/GPX4信号通路，并诱导黑素瘤中的铁死亡。因此，作者推测circPIAS1-108aa可能通过抑制这种特异性通路来抵消IFNγ的影响。通过检测IFNγ诱导下circPIAS1敲低或过表达对P-STAT1/SLC7A11/GPX4信号通路、GSH和MDA水平以及细胞膜脂质过氧化损伤的影响发现，circPIAS1-108aa确实可通过抑制STAT1磷酸化来抵抗IFNγ诱导的免疫性铁死亡，这反过来降低了ICB治疗的有效性。图4.CircPIAS1-108aa通过抑制STAT1磷酸化抵抗IFNγ诱导的免疫原性铁死亡6.circPIAS1-108aa抑制STAT1磷酸化的具体机制通过circPIAS1过表达、敲低和敲除实验来观察STAT1磷酸化水平的变化，作者发现circPIAS1-108aa对STAT1磷酸化的抑制作用是独立的，不依赖于pias1。因此，作者又通过构建STAT1-flag、SUMO1-His和circPIAS1过表达载体，并使用IP和WesternBlot检测STAT1的SUMO化和磷酸化水平，最终发现circPIAS1-108aa通过促进STAT1的SUMO化修饰来抑制其Tyr701位点的磷酸化，从而影响下游信号通路，最终抵抗免疫性铁死亡。图5.circPIAS1通过招募Ranbp2增强STAT1的SUMO化修饰来抑制STAT1的磷酸化7.抑制circPIAS1可以显著增强PD-1抑制剂的抗黑色素瘤效果以上研究均在体外进行，接下来作者为确定circPIAS1在黑色素瘤中的作用及其作为治疗靶点的潜力，进行了一系列体内实验。作者在C57BL/6J小鼠中建立了黑色素瘤皮下接种模型，并分成四组给予不同的治疗，通过观察小鼠体重、脏器健康、肿瘤体积、P-STAT1水平、铁死亡和免疫微环境等来评估疗效，结果发现抑制circPIAS1可以显著增强PD-1抑制剂的抗黑色素瘤效果，这为提高黑色素瘤免疫治疗效果提供了新的思路。图6.抑制circPIAS1可增强PD-1抑制剂抗黑色素瘤效果在这篇文章中，作者巧妙地利用RNA-seq、Ribo-seq和质谱技术，对黑色素瘤肿瘤组织进行分析，并发现了circPIAS1这个在黑色素瘤中高表达且具有编码蛋白的潜力的circRNA。后续通过一系列实验发现，circPIAS1是限制黑色素瘤免疫治疗效果的关键因素。抑制circPIAS1可以增强PD-1抑制剂的抗黑色素瘤作用，为提高ICB治疗效果提供了新的策略。该文章先在体外完成了可编码circRNA的确定+小肽的功能研究+机制探究，接着又构建了小鼠的动物模型，进行了体内实验的功能探究，文章内容十分完整和丰富，有想研究circRNA编码小肽能力研究小伙伴可以借鉴一下此文章的研究思路（图8）。高效挖掘目标circRNA
第一步：候选circRNA筛选。作者结合RNA-seq和Ribo-seq的数据，对ORF进行注释以及junctionreads鉴定，预测具有编码能力的ORF以及circRNA，同时结合差异分析筛选出了17个在联合治疗中表达水平显著低于单药治疗组的CircRNA（图1a）。
（PS：有编码能力的ORF可看翻译组数据，如果三碱基节律满足高低低则证明它是可翻译的;Junctionreads是指RNA-seq或Ribo-seq数据中跨越circRNA连接位点的reads，能直接证明circRNA的存在）第二步：目标circRNA的筛选。作者使用IRES finder软件对这些circRNA的IRES位点活性进行评估，并再次联合差异分析计算差异指数，找到了IRES位点活性显著高于其他circRNA，并且具有明显的差异指数的mmu_circ_0015773（图1b）。（PS：IRES 位点活性显著高意味着该 circRNA 的 IRES 序列具有更强的能力，能够独立于 5’ 端帽子结构直接招募核糖体进行翻译。）这篇文章充分利用了转录组和翻译组的数据，非常高效找到了自己的目标circRNA。对可编码的目标circRNA寻找感到迷茫的小伙伴，也可以参考下这个文章的思路哦！当然除了circRNA，基迪奥还有助力各种非编码RNA编码小肽能力研究的方案（表一）~欢迎大家与我们联系！表1 基迪奥翻译组研究方向之非编码RNA的编码能力分析![]()
下周一开课！小编怕大家还不知道这个消息，只能加紧宣传一波。课程内容十分丰富，不仅包含转录组的整体发文思路讲解，转录组+蛋白/代谢/翻译组/表观组的多组学发文思路也会有所提及哦~R、AI画图的实操课我们也教，感兴趣的小伙伴，欢迎参加基迪奥12月2日至6日的转录组培训班~
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