16S扩增子测序作为微生物研究中最方便的组学，通过实验+16S测序挖掘微生物间的动态关系是研究微生物在群落中作用的重要方式，但仅靠单一或少量的16S测序已经无法满足目前的研究需求，那我们应该如何应用16S数据为研究“添砖加瓦”呢？![]()
联合多组学分析或提升样本数的大样本分析是目前高分研究中常见的16S应用方法，可以分为以下4个应用点：由于16S在扩增时存在一定的偏好性，低丰度的物种无法识别，宏基因组由于是提取环境中的总DNA，因此低丰度的物种也会有所捕获。此外，16S在功能研究上的短板也会被宏基因组补齐，两种组学起到分析互补的效果，多应用于同时研究微生物群落与功能的情况。但在分析时应注意，2个不同的组学在物种注释上使用不同的数据库可能会在物种名称上有一定的差异。在挖掘宿主响应的分子机制与微生物群落变化情况的研究中，16S+转录组是最常用的多组学方式。转录组起到识别关键基因的作用，结合实验对识别的关键基因进行验证；16S可以作为另一层面的宿主表观现象的反馈，通过群落水平的变化反向验证挖掘到的关键基因是否起作用。无论是自然环境还是宿主内环境，微生物产生的多种代谢产物是影响环境变化的重要原因。代谢组可以找到影响宿主或环境的关键代谢产物，结合16S可以找到与关键代谢产物强关联的微生物，结合实验可以进一步验证代谢物与微生物群落变化的关联。然而由于16S无法深入研究微生物的功能，因此代谢组更多与宏基因组关联分析。大样本可以通过机器学习或差异分析的方式识别关键的生物标记物，也是排除样本特异性挖掘普遍规律的重要手段，大样本16S测序也逐渐成为了验证微生物群落分布规律的重要方式。基迪奥客户发表的一篇文章中同时使用了3种微生物组应用方法，下面我们一起通过这篇文章来看看如何实际应用这些方法吧~中风后激活的交感神经下调Toll样受体5并破坏肠壁屏障Cell Reports Medicine（IF=11.7）缺血性中风约占87%占总中风的比例，目前是神经病学研究的主要焦点之一。研究表明，中风会导致肠道屏障受损进而加剧中风的症状，但中风后肠道屏障如何被破坏仍不清楚。设置幽门螺旋杆菌感染破坏肠道黏膜的假手术组作为对照组，测定假手术组与中风后1h、2h的MCAO模型组的16S，识别破坏肠道屏障的关键微生物，进一步测定假手术组和2h组的宏基因组进行分析验证16S结果。测定假手术组与2h组小鼠肠道转录组，识别响应的关键基因；设置敲除与对照组，测定肠道微生物的变化是否符合预期。测定临床患者与健康捐赠者的肛拭子微生物，验证实验识别的关键物种是否在临床中普遍观察到。设置幽门螺旋杆菌破坏肠道粘膜的假手术组作为对照，通过16S测序观察假手术组、1h组和2h组肠道微生物群落组成。结果显示，2h组Alpha多样性显著增加，Beta多样性结果显示2h组与假手术组、1h组微生物组成有显著差异。物种组成分析结果显示，2小时组门水平的Proteobacteria和属水平的Helicobacter的丰度显着增加。LEfSe差异分析的结果也显示Proteobacteria门的Helicobacter属是2h组的主要差异物种。Proteobacteria和Helicobacter通常是有鞭毛的细菌，在2小时组中，预测的基因功能（包括鞭毛组装、细菌趋化性、细菌运动蛋白和表皮细胞信号传递）显着增加。将粪便与粘液微生物比较哦发现，两者微生物组成之间有显著差异，2h组的粪便微生物中Proteobacteria和Helicobacter的丰度并没有明显增加，这表明粘液微生物群由于与宿主接触更密切，更快地受到宿主生理变化的影响。为了进一步识别关键物种，对假手术组和2h组的肠道微生物进行宏基因组测序。Beta多样性结果显示，两组之间微生物组成有显著差异，2小时组的Proteobacteria门，Helicobacter属，Helicobacter ganmani种的丰度高于假手术组，进一步确定Helicobacter的关键作用。LEfSe结果显示，差异物种更多集中于鞭毛细菌，进一步表明鞭毛细菌对肠粘膜损伤的重要性。通过实验研究去除肠道微生物是否会减轻粘液屏障损伤，结果表明，肠道微生物群的缺乏可以保护大脑免受缺血性损伤，粘液微生物群负荷的减少对小鼠的粘液层和脑损伤产生了有益的影响，肠道微生物对粘液层破坏起重要作用，细菌鞭毛蛋白注射实验结果进一步解释了鞭毛蛋白对粘液层破坏的影响。对假手术组和2h组小鼠结肠进行转录组测序，研究粘液微生物变化的潜在机制。转录组结果显示，一种识别细菌鞭毛蛋白的受体Tlr5的表达表现出最显着的变化、免疫球蛋白（Ig）相关基因的下调。进一步通过PCR与蛋白杂交实验证实了TLR5的下调；检测总IgA与鞭毛蛋白特异性IgA水平，证实总IgA水平无显著差异，2h组鞭毛蛋白特异性IgA水平降低。鞭毛蛋白标记检验显示，鞭毛细菌在2h组能够突破粘液屏障到达表皮，在2h组血液、结肠、肝脏中均检测到鞭毛蛋白水平升高。Tlr5基因敲除实验结果显示，Tlr5基因敲除后，诱导抗菌肽表达的重要细胞因子IL-23和IL-2220的水平显著下降。Tlr5基因敲除组中鞭毛蛋白特异性IgA以及多种抗菌肽的水平也明显下降。这些发现揭示了Tlr5信号通路的多种下游产物，其中鞭毛蛋白特异性IgA水平的降低可能是鞭毛细菌数量增加的原因之一。图3 通过转录组识别关键Tlr5与IgA基因并结合实验验证对中风急性期Tlr5表达下调的机制进行进一步研究，由于TLR5的表达在中风后的最初几小时内就被下调，这表明从大脑到肠道的反应非常迅速，推测神经通路可能参与了这一过程。测定了结肠中几种神经递质的浓度，发现1小时组和2小时组的去甲肾上腺素（NA）水平显著升高，而肾上腺素（EPI）、5-羟色胺（5-HT）和P物质（SP）的水平没有显著变化。免疫染色显示，1小时组和2小时组结肠中的酪氨酸羟化酶（TH）+交感神经 NA 纤维明显增加，近端结肠血流量的减少进一步证实了这一点。为了验证交感神经激活会下调TLR5表达的假设，我们采用了两种药物策略（6-OHDA与AY）来激活体内的交感神经。6-OHDA会显著增加NA水平，6-OHDA和AY处理均未改变结肠中5-HT或SP的水平，交感神经激活会显著降低Tlr5的表达。对给药小鼠与对照组小鼠进行16S测序，结果显示粘膜微生物组成显著变化，Proteobacteria和Helicobacter丰度增加，表明交感神经激活下调Tlr5可以导致肠道微生物变化。进一步通过体外实验探讨NA对肠道细胞中TLR5表达的影响，结果显示NA以剂量依赖的方式下调了TLR5的表达。招募了67名急性中风患者，收集患者入院时的血清样本，中风发生后三个月使用mRS对患者进行评估，分为预后不良组和良好组。与34名对照组患者相比，预后不良组患者的鞭毛蛋白水平明显升高，血清NA水平高于其他组，肠道通透性血清生物标志物对中风预后具有重要价值。通过16S检测急性中风患者的粪便微生物组成，与对照组相比，预后不良组鞭毛细菌的数量显著增加，幽门螺杆菌感染中上皮细胞信号转导（PATH：ko05120）和细菌入侵上皮细胞（PATH：ko05100）的基因功能显著增强。16S作为最方便快捷的微生物研究手段，结合多组学或大样本的应用方式是高分文章的研究趋势，基迪奥生物有着丰富的多组学与大样本项目经验，有分析需求的小伙伴可以联系我们哦~![]()
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