空间转录组技术，作为一种能在组织切片上同步获取基因表达信息与空间位置信息的前沿技术，上期我们已阐述其发展历程和主要技术原理（点击此处回顾）。本期将深入探讨该技术是如何有效推进其全部执行步骤的，特别是针对冷冻包埋和石蜡包埋这两种常用的组织包埋方式，详细梳理其在空间转录组实验中的完整执行过程。整个流程涵盖样本准备、包埋、切片、组织优化（冷冻包埋特有）、建库、测序、分析等关键环节。
此外，空间转录组的实验又可以分为两大板块。组织学板块包含样品包埋、切片、固定、染色及成像，用于记录切片的形态学信息，即空间位置信息；组学板块则涉及 cDNA 的合成、扩增、接头连接和测序，旨在记录切片的转录本信息及空间位置信息。为便于理解，我们将按两种包埋方式详细介绍实验步骤。
一、冷冻包埋的全部执行过程
1. 样本准备：
① 组织采集：选取新鲜的组织样本，如肿瘤组织、脑组织等，并尽量缩短从组织离体到冷冻的时间，以减少 RNA 的降解。
② 组织处理：将采集到的组织样本进行清洗和修整，去除表面的血液、杂质等。随后，依据空间捕获芯片的规格，将组织切成大小适宜的小块，精准地将组织切面限制在芯片尺寸范围内，为后续包埋操作奠定良好基础。
2. 冷冻包埋：
① 预处理：把组织样本置于预冷的冷冻保护剂（如 OCT 化合物）中，在低温环境下耐心浸泡一段时间，确保组织充分吸收保护剂，从而有效防止冰晶形成对组织细胞结构造成破坏。
② 包埋：将充分浸泡在冷冻保护剂中的组织样本放入模具，接着把模具放置在粉状干冰上迅速速冻，使组织样本快速冷冻并牢固固定在模具中，形成冷冻包埋块。
3. 切片：
① 准备：将冷冻包埋块固定在冷冻切片机的样品台上，调整切片厚度，一般为 10 μm。
② 切片：使用冷冻切片机，在低温环境下（-20℃左右）将包埋块切成薄片，并将切下的薄片依次贴附在表达芯片上。在切片过程中，要注意保持切片的完整性和连续性，避免出现切片断裂或褶皱等问题。
4. H&E染色：
苏木精-伊红染色（H&E染色）。首先将切片在苏木精染液中染色数分钟，使细胞核染成蓝色。然后用流水冲洗切片，去除多余的染液。接着将切片放入伊红染液中染色，使细胞质染成红色。染色完成后，使用封片剂封片，这样可以在光学显微镜下清晰地观察组织的细胞形态和结构。
5. 明场成像：
针对经过 HE 染色的切片，运用明场光学显微镜进行成像操作。细致调整显微镜的放大倍数、焦距和光照强度等参数，直至获取清晰的组织形态图像。这些图像可用于初步观察组织的结构特征，为后续研究提供重要参考。
6. 组织优化（冰冻包埋特有）：
① 透化液选择：透化液的成分和浓度根据组织类型和实验要求进行选择，其作用是消化组织，释放出mRNA，让芯片更容易捕获mRNA。
② 透化处理：借助组织优化芯片摸索最佳透化时间。首先，设置梯度透化时间，向完成明场成像的芯片添加组织透化液；然后在透化完成的芯片上进行荧光反转录，为成功捕获的 mRNA 添加上荧光标签；反转录完成后，组织移除反应移除芯片上的组织，避免切片对荧光信号产生干扰；最后，使用荧光显微镜对芯片成像，依据荧光成像结果的亮度、弥散程度和组织透化时间，精准选取最佳组织透化时间用于文库构建。
7. 文库构建：
使用表达芯片进行空间转录组文库制备。将完成了明场成像的芯片按照最佳组织透化时间进行组织透化，释放组织mRNA与芯片上的捕获序列结合，逆转录合成cDNA片段并标记空间位置，PCR扩增合成cDNA二链。通过碱性环境使cDNA变性将cDNA二链释放到液体游离环境，以cDNA二链为模板进一步扩增合成大量cDNA。将cDNA酶切打断成200-300bp的片段，加上P5接头、i5样本索引、read 2、i7样本索引和P7接头构建标准测序文库。
8. 测序：
使用Illumina 测序平台进行上机测序。
9. 数据分析：
测序获得的原始数据、组织染色照片和芯片序列号一同输入软件进行数据质控和序列比对，从而获取高质量的测序数据、spot 在组织中的空间分布位置以及基因在各个 spot 的表达量情况。随后利用这些数据开展分群、亚群特征基因分析、spot 注释、空间拟时分析、空间通讯分析等深入研究。
二、石蜡包埋的全部执行过程
1. 样本准备：
① 组织采集与固定：同样选取新鲜的组织样本，修剪至芯片面积大小，迅速放入4% 多聚甲醛固定液中进行固定。固定时间一般为 12-24 小时，以确保组织细胞的形态和结构得到良好的保存，同时固定过程也有助于防止 RNA 的降解。
② 脱水与透明：固定后的组织样本依次经过梯度酒精脱水和二甲苯透明处理。酒精脱水的浓度一般从低到高，如 70%、80%、90%、95%、100%，每个浓度梯度处理一定时间，以去除组织中的水分。然后将脱水后的组织样本放入二甲苯中进行透明处理，使组织变得透明，便于后续的石蜡渗透。
2. 石蜡包埋：
① 浸蜡：将透明后的组织样本放入融化的石蜡中，在一定温度下浸泡一段时间，使石蜡充分渗透到组织中。浸蜡温度一般为 56-60℃，浸蜡时间根据组织大小和类型而定，一般为 2-4 小时。
② 包埋：将浸蜡后的组织样本放入包埋模具中，倒入融化的石蜡，待石蜡冷却凝固后，形成石蜡包埋块。在包埋过程中，要注意组织的方向和位置，以便于后续切片时能够切到需要的组织部位。
3. 切片：
① 准备：将石蜡包埋块固定在石蜡切片机的样品台上，调整切片厚度，一般为5 μm。
② 切片：使用石蜡切片机，将石蜡包埋块切成薄片，并将切下的薄片依次漂浮在温水表面，使切片展平，然后捞起贴附在载玻片上。在切片过程中，要注意保持切片的厚度均匀一致，避免出现切片厚度不均或切片断裂等问题。
4. H&E染色：
苏木精-伊红染色（H&E 染色）。首先将切片放入苏木精染液中染色 5-15 分钟，使细胞核染成蓝色；然后用流水冲洗，去除多余的染液。接着将切片放入伊红染液中染色 1-5 分钟，使细胞质染成红色。染色完成后，使用封片剂封片。
5. 明场成像：
使用显微镜对染色后的组织切片进行成像，观察组织的形态结构、细胞分布情况。成像结果可用于初步评估组织的质量和特征，为后续的分析提供参考。
6. 脱蜡：
在进行探针杂交等后续实验前，需要将石蜡切片进行脱蜡处理。将切片依次放入二甲苯中浸泡 2-3 次，每次 5-10 分钟，以彻底去除石蜡。然后再用梯度酒精进行复水，使切片恢复到水相状态，为后续的实验试剂渗透做好准备。
7. 解交联：
① 反应：将脱蜡复水后的切片放入解交联buffer中，解交联buffer的浓度和孵育时间根据组织类型和实验要求进行优化。解交联buffer可以让与蛋白交联的RNA变成游离状态。
② 清洗：解交联反应完成后，使用合适的缓冲液冲洗切片，以终止解交联buffer的作用，并去除残留的解交联buffer和降解产物。
8. 探针杂交：
① 探针设计与选择：石蜡包埋样本经过甲醛固定和石蜡浸透，mRNA片段化严重并与蛋白质交联，基于polyA尾的mRNA捕获策略已经很难得到高质量的mRNA。所以，在FFPE方案中使用探针杂交的方式对转录本进行检测，不同的试剂盒针对物种有设计好的探针库。
② 杂交反应：将脱蜡复水后的切片与探针混合，在适宜的温度和湿度条件下进行杂交反应。杂交温度一般为50℃，杂交时间最少16 h，使探针与靶标充分结合。
9. 文库制备：
① 探针延伸与连接：杂交完成后，在切片上加入试剂，使探针进行延伸反应，并连接上测序所需的接头等，形成可用于测序的文库构建模板。
② 扩增：以连接后的模板为基础，进行 PCR 扩增，增加文库的 DNA 量。在扩增过程中，需要根据引物和实验要求优化扩增反应条件，控制扩增循环数，一般为 10-15 个循环，以避免非特异性产物的增加。
③ 纯化与定量：对扩增后的文库进行纯化，去除杂质和未反应的试剂，然后使用光谱光度计或荧光定量 PCR 等方法对文库进行质量检测和浓度定量，确保文库质量符合测序要求。
10. 测序：
使用Illumina 测序平台进行上机测序。
11. 数据分析：
与冰冻切片的分析过程相同。
三、小结
以上便是空间转录组执行步骤的详细介绍，不同品牌的试剂盒在操作步骤上可能存在一些差异，后续我们将进一步详细阐述。
如果您有空间转录组项目需求，联系基迪奥客服或当地销售，我们将竭诚为您提供专业的科研服务。
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