前 言
单细胞转录组测序（scRNA-seq）是在单细胞水平上研究基因表达差异的技术，能使我们在单细胞分辨率研究细胞的异质性、发育分化和分子调控机制，但在RNA覆盖度和测序深度上不如普通转录组。而普通转录组测序（bulk RNA-seq）反映的是样本整体的基因转录情况，其RNA覆盖度和测序深度高，是针对基因的高精度研究。
因此，通过将scRNA-seq和bulk RNA-seq相结合，一方面可以将二者进行优势互补，同时发挥scRNA-seq高分辨率和bulk RNA-seq高测序深度的优势，这有助于我们从双维度诠释细胞的分子机制；另一方面，二者的结果还能互相验证，有助于后续的实验设计和验证，提高我们的研究深度，助力高分文章发表。今天，我们一起来聊一聊单细胞转录组和普通转录组的关联分析策略和应用思路。
实验设计思路
（1）先通过普通转录组确定关键基因，再使用单细胞转录组研究对应细胞类型的功能。
关联分析思路一
首先我们来看第一个关联分析思路，其目的在于将核心基因与细胞类型关联起来。普通转录组侧重于基因层面的分析，而单细胞转录组侧重于细胞层面的分析。因此，对于普通转录组，我们可以可以通过差异分析、富集分析等方法筛选得到目标基因集。对于单细胞转录组，我们可以通过组间差异分析或亚群上调基因分析得到的不同细胞类型的组间差异基因或标记基因。接着，可以对这些关键基因进行共有分析，锁定既能解释样本表型又能关联细胞类型的核心基因，再通过这些基因确定我们研究的核心细胞的功能。
图1 两组学关联分析思路一
应用案例一
英文题目：Single-cell transcriptomic analysis reveals the developmental trajectory and transcriptional regulatory networks of pigment glands in Gossypium bickii[1]
发表期刊：Molecular Plant
发表时间：2023年04月
研究背景
棉籽的综合利用受到其色素腺内棉酚的限制，理想的棉花品种应具有无腺体的棉籽和有腺体的植株，但这种特性只在少数野生棉花中发现且很难引入栽培物种。因此，理解色素腺形态发生的生物学过程和相关的分子机制对于培育具有无腺体棉籽和有腺体植株的栽培棉花品种至关重要。
实验设计
（1）scRNA-seq：将比克氏棉（Gossypium bickii）的成熟种子消毒后播种在滤纸上，将滤纸浸泡在水中。播种后48 h取发芽种子的子叶制备原生质体，进行单细胞转录组测序。
（2）bulk RNA-seq：在水中浸泡6 h后，将去壳的棉花种子放在用水浸泡的滤纸上，在连续光照或黑暗条件下进行催芽。在不同时间点（0，12，24，36和48 h）取种子的子叶进行普通转录组测序，每个样品3个生物学重复。
研究结果
棉花子叶色素腺细胞标记基因的鉴定
单细胞转录组数据分析鉴定出14个细胞亚群，通过marker基因进行细胞注释，获得8种细胞类型，包括叶肉细胞（Mesophyll cell）、色素腺细胞（Pigment gland cell）、表皮细胞（Epidermal cell）等（图2A）。为了表征和验证新的细胞标记基因，通过上调基因分析鉴定了在每个细胞亚群中前10个显著上调的基因（图2B）。通过普通转录组研究发现，与有腺体的CCRI12相比，无腺体的CCRI12gl中大部分色素腺细胞标记基因的同源基因均显著下调（图2C），这些新的标记基因将成为区分植物细胞类型的有用工具。
图2 比克氏棉子叶的单细胞图谱和标记基因
拟时分析构建色素腺细胞的发育轨迹
接下来，作者使用再分群分析将色素腺细胞分为3个子亚群：色素腺薄壁细胞、分泌细胞和凋亡细胞（图3A）。进一步构建了它们的分化轨迹，从薄壁细胞开始，接着到分泌细胞，最后以凋亡前细胞结束（图3C）。棉酚生物合成的关键基因在分泌细胞中表达（图3BD）。拟时间轴差异基因分析进一步揭示了参与色素腺发育时空调控的基因的表达模式和功能（图3EF）。
图3 色素腺细胞的发育轨迹
构建色素腺形态发生的转录因子调控网络
最后，作者通过整合DAP-seq和scRNA-seq的结果，建立了以GoPGF为枢纽基因的转录因子网络（图4A）。AP2/ERFs、bHLHs、C2H2s等被证明与GoPGF相互作用，参与调节色素腺实质细胞的形成或从凋亡细胞中释放棉酚（图4B）。利用普通转录组数据分析了上述TFs的表达模式，发现大多数随着种子萌发而增加（图4C），证明了这些TFs可能在棉花色素腺的形成中发挥重要作用。
图4 色素腺细胞发育的转录因子调控网络
关联分析思路二
除了将基因与细胞进行关联外，我们还可以筛选目标细胞进行深入分析。首先，对于单细胞转录组，我们可以通过细胞频率分析，差异基因富集分析来锁定感兴趣的或者对实验处理有显著响应的目标细胞。然后通过流式分选和普通转录组测序针对目标细胞关键基因和通路的调控机制进行深入解析，或者通过实验验证目标细胞或基因的功能。同时两组学的结果又可以互相验证，从而使我们的研究结果更加完整和完善。
图5 两组学关联分析思路二
应用案例二
英文题目：ATM-deficiency-induced microglial activation promotes neurodegeneration in ataxia-telangiectasia[2]
发表期刊：Cell Reports
发表时间：2024年01月
研究背景
ATM基因的功能丧失是共济失调毛细血管扩张症（A-T）的遗传原因，但如何导致小脑浦肯野细胞和颗粒细胞的退化尚不清楚。新出现的证据表明功能失调的小胶质细胞与A-T的发病机制有关，但其作用机制仍不清楚。因此，这篇文章旨在探究A-T中ATM基因缺陷引发的小胶质细胞活化如何促进神经退行性病变。
实验设计
（1）snRNA-seq：A-T患者和对照个体的小脑（6, 7）和前额皮层组织（2, 2）。
图6 文章的实验设计
研究结果
通过细胞频率分析锁定目标细胞亚群
通过单细胞转录组分析一共鉴定出小脑中10种主要的细胞类型（图7A）。进一步通过细胞频率分析发现A-T患者小脑中颗粒细胞（Granule）的丰度显著降低，而星形胶质细胞（Astrocytes）、Bergmann胶质细胞（Bergmann glia）、小胶质细胞（Microglia）和少突胶质细胞（Oligodendrocytes）的丰度显著升高（图7BC）。总之，以上结果揭示了A-T患者小脑中神经胶质细胞群的增加。
图7 A-T患者与对照组的小脑单细胞图谱和细胞频率分析
目标细胞亚群的富集分析
接下来，作者对三种类型小脑细胞中发现的差异表达基因进行了GO富集分析。结果发现A-T患者的浦肯野细胞和颗粒细胞与凋亡信号相关的基因显著上调（图8AB），而小胶质细胞特异性表达免疫反应相关基因，包括与小胶质细胞活化、吞噬作用和细胞因子产生相关的基因（图8C）。通过CD11B免疫染色进一步证明A-T患者小脑中的活化小胶质细胞数量显著多于对照组（图8D）。总之，以上结果表明活化的小胶质细胞可能在神经退行性病变中发挥作用。
图8 关键细胞亚群差异表达基因的富集分析
（A）浦肯野细胞（B）颗粒细胞（C）小胶质细胞
通过普通转录组＋实验验证目标细胞功能
最后，作者对A-T患者和对照组诱导多能干细胞衍生的小胶质细胞进行了普通转录组测序。GO和GSEA富集分析显示，A-T患者的小胶质细胞表现出细胞内在的激活，包括CGAS-STING通路、NF-kB和I型干扰素信号通路的激活（图9BC）。最后，共培养实验结果表明，与对照组相比，A-T患者小胶质细胞在与神经元共培养时显示出增加的细胞毒性（图9D）。总之，以上表明A-T患者小胶质细胞可能通过释放促炎细胞因子对神经元产生毒性作用。
图9 小胶质细胞的富集分析和神经元共培养实验
关联分析思路三
最后，在免疫学，肿瘤生物学等研究领域，还可以将单细胞转录组和普通转录组数据进行整合，通过反卷积分析研究细胞比例和功能的变化。首先，我们可以通过单细胞转录组数据分析构建一个包含每种细胞类型基因表达模式的参考图谱。然后将普通转录组数据与参考图谱进行比较，并使用数学算法来确定不同样本中细胞类型的组成和比例。最后，我们可以分析关键细胞亚群在不同样本中的分布情况，探究它们与表型和处理效应的关联，从而帮助我们深入理解细胞的异质性及其在疾病发生发展过程的作用，为疾病机制和治疗研究提供策略。
图10 两组学关联分析思路三
应用案例三
研究背景
实验设计
（2）bulk RNA-seq：公共数据库中1986名B-ALL患者的普通转录组数据。
研究结果
正常人的B细胞图谱揭示B细胞的动态变化
反卷积分析揭示B细胞发育状态的异质性
多组学分析揭示B细胞发育状态与天冬酰胺酶反应的关系
总 结
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参考文献
[1] Sun Y, Han Y, Sheng K, et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals the developmental trajectory and transcriptional regulatory networks of pigment glands in Gossypium bickii. Molecular Plant, 2023, 16(4): 694-708.
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