道地药材“优形、优质”形成的微进化机制研究进展

道地药材“优形、优质”形成的微进化机制研究进展

张成才1 孙嘉惠1 汪奕衡1 王红阳1 郭秀芝1 闫滨滨1,2 孙智2 王升1,2,3 郭兰萍1,3

1. 中国中医科学院中药资源中心道地药材品质保障与资源持续利用全国重点实验室2. 德兴市中医研究院试验培训基地  3. 农业农村部中药材生物学与栽培重点实验室 

微进化指的是种内或近缘物种之间的进化，又称种内进化(物种内的进化),是由突变、遗传漂变、基因流和自然选择导致的等位基因频率的改变，是生物变异的源头和适应环境的基础。中药道地性表现为“优形”和“优质”,其形成是环境胁迫下多基因数量遗传的微进化过程[1,2,3]。从生物学角度来看，道地药材的形成是遗传与环境交互作用的产物，基因和环境间的交互作用正是多基因数量遗传微进化的重要特点[4,5]。环境胁迫下道地药材的微进化表现为居群和个体(细胞)水平的适应和变异，其适应的机制涉及到道地药材生理生化效应、信号传导及其网络交叉互作、功能基因表达及调控、环境胁迫记忆、表型性状适应等多个水平，呈现出复杂的系统性适应性特点[6,7,8]。因此，通过分析道地药材微进化过程中表型性状在基因组水平上的变异，研究多基因在环境胁迫下的适应规律，是阐明道地药材复杂品质形成机制的关键。

1 中药道地性的特征——“优形、优质”

中药材的道地品质体现为“优形”和“优质”,从生物学角度讲，道地性所反映的主要内容即植物适应性，其中特异的种质资源是道地药材的本质特点，独特的临床疗效是其主要价值特点。道地药材的特殊品质是其基因型、特定的生态环境和栽培措施共同作用的结果，从而塑造了道地药材区别于其他产地同类药材在外观性状、化学组成、药理作用及临床疗效方面特有的品质特征。

1.1 道地药材“优形”特征

道地药材“优形”的形成与遗传因素、环境因素及其相互作用有关，即“表型=基因型+环境饰变”。其中遗传因素主要包括物种群体间遗传变异、表观遗传修饰等；环境因素主要包括气候条件、土壤理化性质、微生物群落组成及动态变化等。道地药材往往具备一些公认的性状特征区别于非道地药材，例如形容野生人参，仅用“芦长、碗密、枣核艼、紧皮细纹、珍珠须”便道出了其与栽培园参的重要区别点；四川江油附子“南瓜叶”;优良三七种质表现出的“铜皮铁骨狮子头”特征，优质冬麻的“鹦哥嘴”或“红小辫”;产于江苏的茅山苍术药材作为道地药材，具备“朱砂点”的特征等。除此之外，药材表面呈现的色泽特征、内部颜色以及炮制前后的色泽变化，也是道地药材“优形”的一种典型表现。谢宗万[9]根据药材外观性状和某些特性与内在质量的相关性，提出了“辨状论质”理论来阐明道地药材本质。“艼”为人参根茎上的不定根，传统上认为“枣核艼”是野山参品相的特征之一，LIU J等以人参为研究对象，发现人参皂苷可以通过PgCLE45-PgWOX11反馈环调控人参不定根的形成，首次从药用植物干细胞调控水平阐释了人参“形-质”合一的分子机制[10]。在“优形”研究中，“优色”具有表征指标明确、成分及代谢途径清晰等特点，可作为优先开展生物学内涵研究的切入点。药材的色素是其基原物种在长期适应生存环境过程中形成的，色素的积累需经过植物体内多种生物代谢途径，受到结构基因、转录因子的控制。如中药丹参以色泽自然、根部紫红色为最佳，LI H等研究表明，SmANS(一种花色素苷生物合成的关键酶)在白花丹参中过表达可增加其花色苷的积累，同时减少了丹酚酸B和迷迭香酸的合成，并恢复了紫红色表型[11],有研究也发现丹参根部越红，其活性成分含量越高，丹参中萜类合酶、CYP76家族蛋白与丹参红色物质-酮基本碳骨架次丹参酮二烯、铁锈醇、柳杉酚、四氢丹参新酮等的催化合成有关，属于丹参“优形、优质”的功能基因表达结果[12,13],同时表明，通过功能基因的表达调控可以提高丹参等药材的品质；铁皮石斛被列为九大仙草之首，在表型性状上，相关研究表明红杆铁皮石斛在品质上普遍优于青杆铁皮石斛[14],YU Z等发现铁皮石斛DoANS和UDP-葡萄糖类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶DoUFGT是合成花色苷的关键基因，可影响飞燕草素和矢车菊素的累积，使茎表现出红色[15];黄酮类成分是红花中主要活性成分，研究表明羟基红花黄色素A的含量与其外在色泽具有显著相关性[16,17]。

1.2 道地药材“优质”特征

道地药材的化学特征是指所含独特化学成分的结构类型、特定的药效物质及有毒成分含量、特有的不同结构化学成分的比例等，这种特定的化学成分谱及各成分的含量和比例体现了道地药材特有的化学品质，也是其发挥良好临床疗效的根本[18]。道地和非道地药材的化学成分特征主要来源于其次生代谢的差异，道地药材正是因为其次生代谢过程产生了有别于种内其他居群的化学型而发挥其良好疗效，即道地药材化学型的生物学本质是次生代谢的微进化。研究发现苍术道地药材具有独特“优质”:苍术道地药材挥发油成分和糖类成分特化，呈现特定配比，道地苍术挥发油中4个组分的配比为苍术酮-苍术素-茅术醇-β-桉叶醇1.2∶1∶0.2∶0.3,非道地为0.4∶1∶22.4∶19.6;道地苍术低聚糖同分异构体(果-果型/蔗-果型)峰面积比值大于1,其他产地均小于1[19]。广布种化学成分变异与地理环境变化显著相关，常呈现出连续变异特点，例如苍术挥发油含量随产地分布发生连续变异，并呈现一定的空间规律，其6种挥发油含量由南向北呈持续下降趋势，这种化学成分呈现空间规律性变异在当归[20]、丹参[21]、菊花[22]、薄荷等中药材中也被发现。中药材化学成分变异受生态环境影响较大，例如郝婧等研究发现温度、水分是百合药材品质形成的关键生态气候因子，高温气候有利于其多糖积累[23]。当影响道地药材化学成分的生态主导因子发生明显变化，其挥发油变异则可能相应地由连续性变异的量变转变为非连续性变异的质变，道地药材化学成分的这种变化是其适应生境的结果，充分体现出复杂系统的自适应特征，这也是道地药材品质形成的微进化过程在化学型上的体现。

2 道地药材品质形成过程符合微进化模型

道地药材的本质是“同种异地”,就是说同一物种长期适应不同的生态环境，其遗传物质发生了一定的变异，形成了各自特有的遗传物质。道地药材品质形成在居群水平表现为基因频率的改变，即为微进化过程，可用公式表示：微进化=遗传变异+变异的不均等传递，其中遗传变异主要指个体水平的基因突变、重组及基因流；变异的不均等传递主要指居群水平的自然选择和遗传漂变，即生物适应环境过程中产生的居群水平的遗传分化。道地药材可被视为物种进化中的一个阶段或状态，基因交流仍在发生，因此在其与同种内其他居群个体尚未达到生殖隔离之前，统称为微进化过程。除此之外，道地药材与非道地药材的品质差异在化学成分上的区别特征通常包括某个化学组分的有或无、化学组分含量高低或者不同成分配比的不同等，这些植物代谢表型上的适应和改变都源于受到了人为选择或环境选择的压力，理论在其进化上都有对应的痕迹，也就是这些特殊代谢产物的微进化过程。道地药材特定的基因组结构及其表型特征是等位基因频率变化的结果，其本质就是微进化过程。

3 道地药材品质形成的微进化研究进展

微进化是发生在物种内的遗传变化，也就是群体(品种/亚种)在世代过程中等位基因频率的变化，微进化分析主要是基于群体分子标记进行分析，关注群体遗传结构、环境适应性等，研究环境压力在基因层面的影响，而基因对环境压力的响应形成了道地药材特异性的表型及生理特点。道地药材品质形成的微进化过程则是存在系谱关系的物种经过多年的自然选择和人工栽培，控制其“优形、优质”的基因经过了多世代的快速积累，使得该优良性状基因可以稳定遗传，进而形成道地药材的特化基因型[24]。通过研究道地药材控制某一优良性状的等位基因频率变化趋势，可以揭示道地药材“优形、优质”相关基因的微进化规律，并可以通过药用植物遗传多样性研究考察种群间遗传进化关系，进而了解药用植物的进化演变，关联生态环境因素还可以推测其生态环境变化过程在道地药材品质形成中的作用。

自2010年公布中药材“丹参”基因组以来，基因组测序在道地药材环境适应性机制解析，“优形、优质”功能基因定位，系统发育与进化地位分析等方面发挥了重要作用。此外，基于数量性状基因座位的代谢组研究也为“道地基因”挖掘提供思路。近年来，道地药材品质形成微进化的研究取得了长足的发展。例如，王娟基于丹参KSL基因“产地趋向变异”规律对丹参道地性遗传特征进行了解析，结果表明山西产丹参的催化效能最高，从一定程度上印证了丹参的道地性[25]。WANG Z H等研究发现，CYP基因的优先保留和调节差异，促进了现存人参物种中次生代谢物的定性多样化；CYP716亚家族中的新功能和基因亚功能化，可能导致人参皂苷在结构和功能上的巨大差异，说明了CYP基因在人参道地药材品质形成的微进化过程中发挥了重要作用[26]。XU Y等通过将天麻与独脚金、菟丝子等植物进行比较分析，发现天麻基因家族收缩与其生长习性密切相关，在与蜜环菌共生过程中丢失部分保守性基因，包括涉及光合作用、生物钟、开花时间调控等基因。这说明，天麻基因丢失及其生理变化是为了对生存环境改变而做出的适应性微进化[27]。

3.1 分子标记推动的道地药材非功能性微进化研究

3.1.1 第一代分子标记

基于PCR基础发展而来的随机扩增长度多态性DNA(RAPD)和扩增片段长度多态性(AFLP)DNA指纹技术是20世纪90年代发展起来的2种重要的遗传标记，也被称为第一代遗传标记，已成功应用在道地药材产地鉴别、系谱进化分析和品种鉴定及良种选育等方面的研究。郭宝林等对厚朴11个产地33个个体的RAPD分析表明，厚朴的道地性来源于遗传差异，“川朴”和“温朴”具有明显的遗传分化，且与药效成分相关，其开发出的RAPD分子标记可用于正品厚朴的分子鉴定[28]。刘晓莹等利用DNA-AFLP分子标记对不同产地广藿香的亲缘关系进行研究，结果显示，在分子水平上广藿香种间的遗传多样性十分丰富，种内遗传多样性则相对较小[29]。赵艮贵等研究发现RAPD和AFLP均可以对柴胡属种质资源进行遗传关系分析，但AFLP条带较多，多样性丰富，更有利于柴胡属植物多样性的分析[30]。郭兰萍等基于RAPD分析考察了苍术的遗传特性，并探讨不同产地苍术遗传多样性，结果表明苍术种内遗传多样性水平较高，其遗传变异主要分布在居群内，茅山苍术在长期适应环境的过程中，已经发生遗传上的分化[31]。

此外，18S rRNA基因和ITS序列也是最常用的分子标记之一，被广泛用于系统发育树的构建和群体遗传结构分析。18S rRNA基因是真核生物中编码核糖体小亚基的DNA序列，是唯一具有信息分子和功能分子2种作用的编码nrDNA基因，以连续排列方式存在于细胞内，序列长约1 850 bp, 其中既有保守区，也有可变区(V1～V9,无V6区)[32,33]。基于信息分子作用的18S rRNA基因广泛应用于道地药材分子鉴定、种群亲缘关系及遗传差异分析等方面，如恩施州道地药材五鹤续断以“乌梅花心”特征闻名，传统的药材鉴别方法主要通过其形态特征和活性成分含量，具有一定的局限性，罗洪斌等发现五鹤续断18S rRNA基因序列与其亲缘物种相比仅发现3个变异位点，其余序列完全相同，反映了其种内遗传稳定性[34]。内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)指位于18S～26S基因的片段，被5.8S分为ITS1和ITS2 2个部分，作为nrDNA的非编码区，其承受的选择压力较小，导致ITS序列进化速度快、变异性高，在大多数生物中表现出广泛的序列多态性[35]。又因ITS区域在核基因组中高度重复，既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守性，其长度和序列在物种间的差异相对较大，因此常被用于物种鉴定和种内遗传多样性分析[36]。ITS序列这些特点使得其在道地药材品质形成的微进化研究和药材真伪鉴定方面具有独特优势，已在许多中药材研究中得到了广泛应用，如张君毅等对我国不同地区半夏rDNA的ITS序列进行分析，得出半夏rDNA变异与其地理分布相关，半夏“道地性”的形成与居群遗传物质微进化和道地产区生态环境密切相关[37]。

3.1.2 第二代分子标记

第二代分子标记微卫星标记，也称为短串联重复序列(STR)或简单重复序列(SSR),一般由2～6个核苷酸组成，是一类广泛存在于高等生物基因组中的DNA多态性碱基座。它具有多态性高、稳定可靠等特点，因此是一种十分理想的分子标记，在数量性状位点(QTL)定位和遗传检测等领域应用广泛，相比于RAPD和AFLP等指纹技术，微卫星具有数量多、特异性强、共显性、多态性信息丰富和在基因组内分布均匀等优点，成为道地药材群体遗传学研究的有力工具[38]。如张文芳利用5个SSR分子标记对22种山药居群进行了遗传多样性分析，发现不同山药群体间由于遗传漂变发生了分化，盾叶薯蓣与其他山药品种发生了明显的遗传分化[39];周荣荣等使用生物信息学方法分析了药用野葛基因组SSR序列，并从中筛选出5对多态性较强、扩增带型稳定的引物，对江西产区9个不同粉葛栽培种进行遗传多样性分析，建立了江西粉葛种质DNA身份证，为粉葛优良种质筛选和中药材道地性研究提供参考信息[40]。董晓曼等也基于SSR指纹图谱分析构建了滇皖产区铁皮石斛居群分子身份证[41]。CHEN F等利用SSR标记对药用唐古特大黄进行了遗传多样性和种群结构分析，结果表明唐古特大黄种内和种间的遗传变异水平均较高，其濒危原因主要是滥采滥挖导致而不是遗传多样性低，人为因素和产地环境共同塑造了该物种的遗传结构[42],该结果也表明道地药材野生居群的遗传多样性是长期适应性进化的结果，环境适应能力强的物种往往也具备更丰富的遗传变异，这种现象在广布物种中更明显。简单重复序列间扩增(ISSR)是在微卫星基础上发展起来的一类新型分子标记技术，可以在不同的物种间通用且开发成本低，兼具SSR、AFLP等其他分子标记优势，在药用植物物种遗传物质分化、中药道地性鉴定、进化及分子生态学、遗传图谱构建以及分子标记辅助育种方面都有应用[43,44]。如雷栗等采用ISSR分子标记考察了江西产栀子道地药材的遗传关系，结果表明产于樟树的栀子遗传多样性最高，可能种源相对比较广；丰城和新干的样品地理距离比较远，但是遗传距离却比较近，可能是各地之间存在相互引种现象，基于栀子的ISSR遗传多态性的聚类分析结果与栀子产区的地理分布比较吻合，这为从分子生物学角度研究栀子的道地性提供了新的启示[45]。徐敏等利用RAPD和ISSR分子标记筛选遗传多样性最高的五味子品种用于五味子优良种质资源创新和品种改良[46]。

3.1.3 第三代分子标记

单核酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP),主要是指在基因组水平上由单个核苷酸(A/T/C/G)的替换所引起的DNA序列多态性。与其他分子标记相比，SNP分辨率较高也较为丰富，覆盖基因组范围大，遗传上比较稳定，是继微卫星之后的第三代遗传标记，目前已成为在全基因组水平上研究物种遗传多样性、进化关系和目标性状候选基因的首选。王尧龙以金银花药材为研究材料，选择与产地变化密切相关的miRNA和SNP标记，对不同产地，不同种质的金银花进行系统性的研究分析，结果表明河南金银花与其他产地金银花出现了不同的SNP位点，可用于金银花道地产区的鉴别[47]。臧艺玫等采用PCR-SSCP和测序组合技术检测了6个产地甘草的β-香树脂醇合成酶(β-AS)基因的SNP,并进行了SNP和产地的相关性分析，结果表明甘草β-AS基因第一外显子存在1处SNP,可将甘草划分为94A型、94G型和94A/G型3种基因型，其中94A型在道地产区所占比例要远远高于非道地产区，证明了甘草β-AS基因94位点的SNP可能是导致甘草道地性形成的机制之一[48]。胡安琪基于SNP开展了桃金娘种质资源遗传多样性研究，探讨其地理遗传差异，结果表明全国桃金娘可分为7个类群，桃金娘经常形成单一的优势种群落，并且保持较好遗传多样性，其独特的微进化系统和通过鸟类传播种子特性，使得桃金娘具有较强的抗逆性和抗旱性[49]。LIAO B等基于36个个体的黄花蒿全基因组重测序SNP结果显示黄花蒿种群中具有高度的遗传多样性[50]。

基于基因组重测序和群体遗传分析开发SNP,可以从微进化的角度解释道地药材的适应性进化机制，同时SNP分子标记在道地药材“优形”性状基因定位中也被广泛应用，为中药材道地性研究提供新的途径。如董林林等基于简化基因组测序技术筛选出的抗病群体的特异SNP位点进行分子辅助育种成功培育出三七新品种，为道地药材的种质资源创新提供重要的基因资源[51]。闫国跃基于转录组数据开发出的SNP分子标记对苦玄参遗传多样性及有效成分关联位点进行分析，得出苦玄参种质地理分布差异与区域间遗传交叉相关，其不同产地均出现不同程度分化，广西和云南两地野生种质分化明显；以苦玄参有效成分含量为目标性状的关联结果表明，其SNP关联位点基因功能主要涉及信号转录、甲基化、基因修饰[52]。杨赟等基于全基因重测序技术对“红叶”杜仲进行SNP位点开发，并筛选得到了花色苷或类黄酮合成相关的酶基因，揭示了杜仲红叶性状的遗传基础和分子机制[53]。范宏虹等利用全基因组关联分析对58份切花菊进行寒性相关等位变异和候选基因挖掘，为切花菊耐寒品种选育提供参考[54]。

3.2 组学技术推动的道地药材功能基因微进化研究

3.2.1 基因组

随着基因测序和组装新技术的出现以及价格的大幅降低，利用基因组学研究药用植物成为研究热点。基因组学研究不仅使人们对参与药用植物代谢物生物合成的构成性基因和调控基因有了认识，还对植物界代谢物多样性的进化有了更广泛的了解，基因组分析是特征天然产物微进化研究的有效手段。目前，已有100余种药用植物完成全基因组测序，其中红豆杉的基因组最大，达到10.23 Gb, 其次为银杏(9.87 Gb)、买麻藤(4.07 Gb)和人参(3.43 Gb)[55]。基因组测序为阐明道地药材微进化历程提供新的技术和方法。例如，2018年GUO L等测序完成了鸦片罂粟Papaver somniferum基因组并发现吗啡碱合成酶基因呈超级簇模式在第11号染色体上聚集分布，进一步分析表明该基因簇的进化起源是由全基因组复制事件与多次基因融合、重排共同作用所致[56]。又如，2021年KANG M等测序完成了喜树基因组Camptotheca acuminata,并发现喜树经历了1次独有的全基因组复制事件，特别是喜树碱途径中断马钱子酸合酶基因就是由这次全基因组复制推动产生了2个基因拷贝，并且这2个基因拷贝随后经历了不同的正向选择进化历程，这对研究喜树高效合成喜树碱类化合物具有很大的贡献[57]。适应性进化会产生适应生存地环境的表型变异，适应性表型变异通常与气候因子密切相关，气候因子是适应性产生的主要选择压力，通过环境因子与基因组互作位点分析，能够明确全基因组水平各环境因子的适应模式。TERGEMINA E等通过对147份种质资源在相同环境下适应性的预测验证了适应位点检测的准确性；鉴定出的选择性清除位点与环境适应相关位点具有很高的重叠率，提出选择性清除是拟南芥适应性进化的主要模式[58],该研究方案对后续探究基因与环境交互作用下的道地药材的微进化过程也具有重要参考价值。JIANG L等破译了兰科植物第一个高质量的单倍型基因组，首次重构了18条兰科植物古代染色体的祖先核型和16条白及现代染色体的微进化轨迹。比较基因组分析表明，白及基因家族的扩张可能在次级代谢产物生物合成和环境适应中发挥重要作用，白及经历了2轮全基因组复制(WGD)事件，该结果为兰科植物进化提供了新见解，并通过多组学研究与实验，揭示了白及多糖合成的机制[59]。WANG Q等通过对39份茯苓的基因组进行分析，为其种群结构和高产相关基因研究提供了新的见解。通过群体基因组学对茯苓重要性状相关基因进行定位，发现与茯苓产量相关的候选基因主要富集于氧化还原和碳水化合物代谢途径中，并且这些基因在最高产量的茯苓株系中得到高度表达；茯苓主要分为3个种群，并且具有共同的起源[60]。

3.2.2 转录组

转录组(transcriptome)是特定发育阶段或生理条件下，细胞中基因转录的所有RNA的总和，由4种脱氧核苷酸编码的序列如何影响道地药材品质形成各种生理变化，很难直接从基因组水平进行解释，转录组技术则可以弥足这一不足。目前，转录组技术在药用植物有效成分生物合成与调控、药材道地性分子机制和阐明基因功能等方面的应用已十分广泛。通过转录组测序，还可以挖掘参与道地药材品质形成的优良性状基因，对于药用植物的保护和种质创新具有重大的意义。例如，丹参中丹参酮的生物合成途径的解析及丹参酮类化合物积累的调控机制、人参皂苷生物合成途径关键酶基因发掘、甘草中甘草酸积累相关CYP450基因的挖掘和皂苷的转运机制以及不同生长年限蒙古黄芪三萜皂苷合成关键基因的挖掘等，转录组测序在药用有效成分的合成与调控的研究中已经成为一种非常有效的手段[61,62]。SUN X等利用植物广泛靶向代谢组和转录组学技术解析不同生态型肉苁蓉的质量差异及内在调控机制，结果表明与PhGs相关合成通路的调控是导致不同产地肉苁蓉的“优质”性状——2′-乙酰毛蕊花糖苷具有明显差异的主要原因，盐碱地更有利于积累与PhGs相关的活性代谢物，证明了“逆境胁迫”有利于肉苁蓉中药用活性成分的积累[63]。JIAO H等发现SOC1-like转录因子是调控人参根系形态和人参皂苷生物合成的关键调节因子，在道地药材“优形、优质”建成中具有重要作用[64]。

3.2.3 代谢组

为了适应环境变化，维持最适宜药材生长发育的需求，植物将合成特定的天然产物或次生代谢物。这些小分子代谢物正是中药材发挥药用效应的化学基础，也是研发生物医药、生物农药的资源库。代谢组是代谢产物的集合，代谢组学通过对不同生物体、样本或组织进行全面定性、定量分析，系统生物学的组成部分，并成功应用到对药用植物的系统研究中。药用百部广泛分布在长江以南，其基原植物包括3个品种，但对百部药效成分的评价一直缺乏相关标准。中国科学院上海药物所叶阳等基于UHPLC-QTOF平台对我国不同产地的200余种百部药材进行了代谢谱分析，并结合系统化学成分和止咳活性研究成果，证实了百部种间和种内代谢物差异显著，并鉴定了各种表型的标志性化合物[65]。百部药材代谢图谱的绘制对阐明“道地药材”合理性以及中药百部的标准化提供了坚实的科学依据。YANG F等通过UHPLC-QTOF-MS/MS对决明子原、加工样品进行植物代谢谱分析，并联合谱效关系揭示决明子中潜在的降血糖代谢物，为其质量控制提供参考依据[66]。ZHAO M等建立了干旱胁迫下菊芋叶片的代谢网络，为选育抗旱品种奠定基础[67]。ZHANG C等基于UPLC-MS/MS的代谢组学对不同产地的金荞麦药材进行了产地鉴别和质量评价，结果表明云南省可作为高品质药材产地之一，并筛选出3个化合物标志物用作金荞麦产地鉴别之一[68]。代谢组分析具有独特优势，通过对植物中次生代谢产物的定性定量检测，从化学成分角度考察其中某类/某几类活性或特征性成分的组成和分布，可以全面分析其疗效、安全性、环境等多个因素的关联。

3.2.4 表观组

道地药材品质形成的微进化过程也受表观遗传修饰影响，这种由于环境作用导致基因表达发生可遗传变异，但其DNA序列并未改变的调控方式，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、组蛋白乙酰化、RNA干扰和非编码RNA等类型。大量研究表明，表观遗传修饰在道地药材“优形、优质”形成中发挥重要作用，如HAO M等通过比较野生和栽培人参群体中17个单株的甲基化变化，表明CG和CNG位点甲基化水平存在显著差异，长脖型和石柱人参的甲基化水平显著低于野生人参[69],YU Y等研究发现低温可通过诱导人参DNA甲基化水平发生变化，进而影响与人参皂苷生物合成、生长发育相关基因表达水平[70]。基因型和环境交互作用所产生的非遗传效应(表观遗传),充分说明了环境因子对道地药材的重要性，如蒋超等检测金银花酚酸和环烯醚萜关键酶基因的DNA 5′-UTR区CpG甲基化时，发现22个采样点的39个不同种质金银花可聚为4个大支，分别对应华北地区、中原地区、华南地区和西部地区，说明种质相同的药材，在道地产区和非道地产区生长或种植后，其药材质量出现明显差异。VERHOEVEN K J F等对蒲公英Taraxacum officinale无性系DNA甲基化的研究表明：胁迫处理组中甲基化位点改变的比例比对照组的高，而且发现DNA甲基化的改变能够延续到它们的后代[71],说明经历胁迫的植物后代即使在没有胁迫条件下，也显示出基因组整体的超甲基化状态，这种超甲基化可能是植物采取的一种胁迫环境下维持基因组稳定性的防御机制。由此可见，不同生态胁迫对同一品种的长期影响可能会形成独特的药材表观遗传模式，从而产生药材道地性表型特征，而不同产地间药材表观遗传的变异可以来自于随机的表观突变，但更主要还是来源于由环境变化产生的压力。从表观遗传的角度来看，变异的诱因一方面是药材环境适应性变化的选择者，另一方面在环境压力的选择下，表观突变速率往往远高于基因突变，体现了环境因素是道地药材品质形成微进化过程的根本动力，而时间和空间的连续性造就药材遗传与表型的连续性。

3.2.5 多组学联合分析

代谢物是基因-转录-翻译的最终产物，也是道地药材“优质”的物质基础，其产生涉及到多个生物学过程。多组学联合分析可以对生物学问题进行多维度信息表征，从而避免单一组学不能解析生物系统宏观发育过程的难题。生物过程具有复杂性和整体性，多组学相互验证，可以快速鉴定与代谢相关的功能基因，是道地药材表型(特征天然产物)和特化基因型微进化研究的有效手段，例如，代谢组可以用于绘制不同产地中药材代谢物地理图谱，并利用二代测序技术获得群体材料的基因型数据(genotype)开展基于代谢物的全基因组关联分析，即mGWAS(metabolome genome-wide association study)分析，把小分子化合物作为代谢性状或者某些道地药材“优质”的代表表型。mGWAS分析有利于批量定位调控代谢物的候选基因，挖掘调控道地药材“优质”形成和环境应答等相关代谢通路，深入了解道地药材品质形成的遗传机制，从而搭建起“基因组-表型”的桥梁。如YIN Q等结合多组学联合分析发现UGT73A18和UGT74T4等基因参与人参的抗逆境胁迫，促进其高品质形成[72]。HAN X等整合基因组、转录组和代谢组分析揭示了当归香豆素生物合成的分子机制和进化过程，为加快香豆素的遗传研究和分子育种提供了参考依据，证明了全基因组复制(WGD)专门发生在芹亚科，串联重复有助于当归苯丙素类成分的生物合成，并发现桑科、豆科、芸香科和伞形科中参与呋喃香豆素生物合成的烯酰基转移酶在ζ和ε WGD事件后进行独立进化[73]。MIAO Y等公布了蕲艾高质量染色体级别基因组，为解析艾叶中特征天然代谢产物的生物合成路径和微进化过程奠定了基础，揭示了广泛的基因扩增和串联重复是艾黄酮类化合物和挥发油含量丰富的原因，并推测艾的3次全基因组复制事件是导致其超大基因组的主要原因，同时发现染色体融合是蒿属植物染色体进化过程中的关键机制，为研究蒿属植物进化奠定了基础[74]。田丽霞以北京、吉林及山东3个主产地西洋参及其根际土壤为研究材料，基于微生物组、转录组和叶绿体基因组等多组学技术探究气候因子对其品质形成的影响，研究发现昼夜温差是影响西洋参中人参皂苷含量的重要生态因子，适冷微生物假裸囊菌属Pseudogymnoascus可以促进西洋参“优质”特征形成；转录组结果进一步表明差异基因涉及人参皂苷生物合成途径中SQE、HMGR、HMGS和SS等关键酶[75]。黄酮类和萜烯类化合物作为广陈皮“优质”性状，也是其道地性鉴定的主要指标性成分，在临床疗效中起着重要作用。SU J等利用转录组、代谢组以及宏基因组等多组学方法揭示了道地产区特殊的土壤环境以及微生物组成促进了广陈皮单帖合成和积累的生物学机制[76]。LIU Y等基于黄连基因组，全面分析了黄连生物碱合成相关基因的分布方式和微进化途径。结果表明，CYP719家族的P450基因在黄连的生物碱多样化过程中起到了关键作用，其多数家族基因在黄连以串联重复的方式排布，包括小檗碱合成关键基因CAS[77]。

4 结语与展望

4.1 多组学、多学科交叉分析助力道地药材“优形、优质”形成的微进化研究

道地药材是中药资源的核心，用现代科学语言解读道地性的科学内涵，是继承好、发展好、利用好中医药这一宝库的关键。遗传变异和环境适应性微进化是道地药材品质形成的主要原因，自然选择是道地药材微进化机制的核心，自然群体中发生的突变是随机的和足够的，足以对付任何选择的压力，绝大多数生物对环境有着惊人的适应性，而自然选择是促使群体适应性变化的一个重要因素。基因突变及突变的选择促进了生物的进化，环境压力可造成基因的漂移并使遗传趋于稳定，通过分析生物遗传结构，可获得所研究物种的起源和进化信息，对药用植物资源的道地性表现差异也可做出合理解释。近年来，中药基因组学在中药繁育、探索中药成分合成的生物学机制和建立道地药材基因库方面发挥了重要作用，为传统中药的推广和使用提供了前所未有的契机，同时新兴组学技术的应用也可以为阐明道地药材潜在的分子微进化机制以及筛选优良品种提供全新而有效的方法。

4.2 道地药材“优形、优质”形成的微进化机制研究存在的问题及展望

道地药材是指经过长期临床实践优选出来的，产在特定地域，与其他产区所产同种中药材相比，品质和疗效更好，质量稳定，且具有较高知名度的药材。基于“辨状论质”的中药材“优形、优质”研究，为道地药材的性状与品质的相关性研究奠定了基础，但中药品质在与药效的关联分析中存在明显不足。因此，后续应当建立道地药材“优形-优质-优效”相关性研究模式，进一步提高道地药材品质评价标准。

目前，关于道地药材品质形成的微进化过程研究多停留在遗传多样性和环境适应性的基本分析和描述，缺乏对基因组精细结构的解析和相关功能基因的深入分析。从生物学角度来讲，道地药材的形成是遗传与环境的交互作用的产物。遗传变异和生态环境的交互作用，大大丰富了中药材原物种种质的多样性和种质资源，为道地药材品质形成提供了生态生物学基础。因此，对遗传与环境的交互作用的研究是微进化研究的重要内容，也是道地药材形成机制研究的关键，现今发展迅猛的分子谱系地理学、分子生态学、表观遗传等相关学科为这一领域的研究提供了很好的思路和方法。

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排版：陈金秋     审核：蒋涵如  

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声明：本文来源于中国中药杂志. 2023,48(22)。分享仅为传播中药基础知识，其版权归原作者所有，文中观点仅代表作者本人，不代表本平台立场，感谢原作者的辛苦付出。转载请标明来源。若有异议，将做删除处理。

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