Cell 子刊：APP C端片段积累通过晚期内体与溶酶体-ER接触位点的失调引发内溶酶体功能障碍

神经元内体和溶酶体异常是阿尔茨海默病( Alzheimer ' s disease，AD )在斑块出现之前观察到的早期变化之一。然而，目前尚不清楚不同的内溶酶体缺陷是否具有时间上的组织性，以及γ-分泌酶的功能或淀粉样前体蛋白( APP )代谢的改变如何导致这些变化。近期，《Developmental Cell》期刊发表了题为“Accumulation of APP C-terminal fragments causes endolysosomal dysfunction through the dysregulation of late endosome to lysosome-ER contact sites”的文章，作者发现长期抑制小鼠胚胎成纤维细胞和海马神经元中的γ-分泌酶，会引起溶酶体钙减少和胆固醇增加导致内溶酶体逐渐崩溃，从而导致内体循环和成熟的下游缺陷。这种内溶酶体的死亡依赖于γ-分泌酶，需要膜锚定的APP胞质结构域，并通过APP的耗竭来挽救。APP C末端片段( CTFs )定位于晚期内体/溶酶体-内质网接触处，此处过量的APP - CTFs减少了溶酶体Ca^{2 +}从内质网的重新填充，促进了胆固醇的积累。APP - CTFs的调节为其细胞毒性提供了一种机理性的解释：未能及时降解的APP – CTFs会维持下游信号，导致溶酶体稳态失调，如在前驱AD中观察到的那样。这与Notch等需要膜内蛋白水解来启动信号传导的底物的观点相反。

早老蛋白1和2( PSEN1和2 )是γ-分泌酶的催化亚基，它们可以水解淀粉样前体蛋白( APP )，产生不同长度的淀粉样β肽( Aβs )。与家族性阿尔茨海默病( FAD )相关的APP和PSEN基因中的显性遗传突变会降低γ-分泌酶持续合成能力，导致产生更长的、更易聚集的Aβ，并加速AD患者大脑老年斑中Aβ的沉积。然而，关于毒性Aβs在触发和/或驱动阿尔茨海默病( AD )神经退行性级联反应中的作用程度仍存在争议。

重要的是，正如在死后AD大脑中观察到的那样，自噬溶酶体功能障碍与AD的病因病理学有关。在AD大脑和小鼠模型中，异常增大的内体先于细胞外淀粉样斑块和神经原纤维缠结的出现，使其成为神经元死亡的早期病理生物学标志。遗传学证据支持内溶酶体稳态改变的重要性，全基因组关联研究已经确定了与胆固醇代谢、内吞转运调节和溶酶体过程相关的基因的迟发性AD相关的风险变异，内溶酶体病理是与单基因FAD共有的趋同机制。

Kwart等人发现，在具有FAD APP或PSEN1突变的诱导多能干细胞( iPSC )衍生的人神经元中，Rab5阳性内体增大，并且随着联合突变而恶化，这表明对内体溶酶体系统具有协同作用。Hung和同事观察到由于APP和PSEN1突变导致的溶酶体和自噬途径的共同缺陷。此外，APP介导的Rab5阳性内体的增大破坏了轴突转运和神经生长因子信号，导致细胞死亡。在此，APPL1的募集可能通过稳定Rab5 - GTP，导致内体异常，在级联反应早期与 Rab5 过度激活相关联，导致内溶酶体稳态紊乱。APP和PSEN1的作用需要进一步阐明，但内吞细胞隔室的扰动可能会改变APP蛋白水解片段的丰度和质量，相反，APP和PSENs中FAD连接的突变可能会破坏内体溶酶体稳态和降解能力。虽然细胞内Aβ42的毒性与晚期内体有关，但目前人们关注的焦点集中在APP β C末端片段( βCTFs )在内溶酶体功能障碍中的作用。为了支持这一观点，在FAD关联的PSEN1或APP和SorL1突变的模型中，BACE – 1抑制剂纠正了内体、溶酶体和自噬的缺陷，消耗APP还可减轻溶酶体或自噬途径中的晚期缺陷。

如果说最近的这些报道强调了APP - CTFs的作用，那么PSENs本身也通过各种机制调节内溶酶体稳态。PSEN缺陷或PSEN1 FAD突变可能通过V - ATP酶功能缺陷损害溶酶体酸化，而其他研究强调溶酶体Ca^{2 +}稳态和营养感应和清除的失调。值得注意的是，缺陷在整个内溶酶体途径中都很明显，甚至会影响自噬，但它们的启动时序尚不清楚。例如，过量的APP-β-CTFs可能会引起早期的内体紊乱，但其确切机制尚不清楚。但是，与此相反，APP -β-CTFs最近出现了对V - ATP酶的调控作用，这表明在包括溶酶体在内的后期区室中存在主要缺陷。

为了解决这些问题，作者利用CRISPR - Cas9编辑产生了新型的PSEN双敲除( PSENdKO )和APP KO细胞，使作者能够在其他同源背景下系统地剖析这些基因的贡献。作者的研究结果表明，PSEN / γ-分泌酶失活导致的APP - CTFs的大量积累会影响溶酶体Ca^{2 +}稳态，从而引发一系列事件的发生，扰乱了内溶酶体的循环和分选，最终导致内溶酶体成熟的崩溃。APP KO挽救了这些时序性缺陷，这种缺陷可以通过重新引入膜结合的APP胞内结构域( AICD )来缓解，从而缩小对下游APP - CTFs信号的影响。机制上，作者通过APP - CTFs在晚期内吞体/溶酶体( LE / Lys ) -内质网( ER )接触位点或附近的聚集，影响溶酶体Ca^{2 +}从ER的重新填充来解释这一现象。作者的研究结果表明，LE / Lys - ER膜接触位点( MCSs )中平衡的APP - CTF水平对维持内溶酶体稳态至关重要。本文中 APP-CTFs 升高的有害影响强调了它们作为治疗靶点的重要性，可在淀粉样斑块出现之前早期治疗 AD 进展。

为了解决观察到的导致内溶酶体系统广泛失效的事件序列，作者用γ-分泌酶抑制剂DAPT处理野生型( WT )小鼠胚胎成纤维细胞( MEFs ) 4天( 1μM )。DAPT处理的细胞在溶酶体相关膜蛋白1 ( LAMP1 )阳性的LE / Lys (图1A和1B)中快速积累APP - CTFs (图S1A )。在Fura2 - AM负载的细胞中，用GPN进行评估，发现这种积累与溶酶体Ca^{2 +}含量的显著降低密切相关(图S1B )。此外，DAPT处理的细胞开始在LE / Lys中积累胆固醇，然而，仅从第2天开始胆固醇的积累程度才显著(图1A ~ 1D)。当研究内体区室时，VPS35阳性细胞器的大小增加(图1E和1F)，这强调了内体循环中存在的潜在缺陷，尽管这只发生在DAPT处理3天后，因此是位于溶酶体功能障碍的下游。重要的是，通过早期核内体抗原- 1 (EEA1 )鉴定的早期核内体仅在处理4 天后才显著增大，表明是晚期事件(图1I和1J)。细胞器大小的增加与VPS35和EEA1与LAMP1的共定位增加同时发生，这表明DAPT处理的细胞中内体到溶酶体的成熟普遍延迟以及早期和晚期内体腔室的逐渐部分塌陷(图1H ~ 1L)。APP - CTFs在早期塌陷到晚期和循环内体中的共定位增加进一步佐证了这一点(图1B和1G)。值得注意的是，在原代小鼠海马神经元中也得到了类似的结果，在DAPT处理1天后，溶酶体Ca^{2 +}反应显著降低(图S1C )，而EEA1和VPS35阳性的内体与LAMP1阳性的溶酶体的共定位增加仅在处理后4天明显(图2A ~2D和S1D)。内溶酶体腔室颗粒面积的增加以及VPS35和LAMP1阳性腔室中APP - CTFs的积聚进一步证实了溶酶体的整体崩解(图2E ~2J和S1E)，这些数据支持溶酶体功能障碍是内溶酶体崩溃的根源这一说法。从EEA1和VPS35与LAMP1共定位增加可见一斑，PSEN1缺陷的DIV 14原代海马神经元主要表现为内体和溶酶体增大，溶酶体Ca^{2 +}减少，内溶酶体塌陷(图2K2P和S1F)。有趣的是，作者发现 VPS35 与 ICAM5 共定位（图 S1G），ICAM5 是一种神经元粘附分子，此前发现它在 PSEN1^-/-海马神经元的自噬样空泡中异常积聚，这表明内溶酶体崩溃可能最终导致功能失调的细胞器进行自噬。

图1：慢性γ-分泌酶抑制可确定内溶酶体缺陷的发生时间

由于作者已经证明APP - CTFs的N端不是观察到的内溶酶体缺陷的区分因素，作者接下来将重点放在了AICD (图4G )。虽然γ-分泌酶加工会启动下游(核)信号传导，例如，在Notch的情况下，可能需要膜内其他底物的蛋白水解来消除它们的功能。越来越多的报道认为APP - CTF的积累是一系列内溶酶体缺陷的诱因，这表明( 1 ) APP - CTFs能够激发细胞信号传导，( 2 )细胞需要通过γ-分泌酶处理来保持APP - CTF的水平。为了验证这一假设，作者稳定地表达了具有肉豆蔻酰化基序（mAICD）的 N 末端修饰的 AICD，确保了膜锚在PSENdKO/APPKO 细胞中（图 4G）。在PSENdKO和APP – CTF挽救的PSENdKO - APPKO细胞中，m AICD的表达完全恢复了内溶酶体缺陷。特别是，m AICD的表达降低了溶酶体Ca^{2 +}含量(图4O )，促进了EEA1 -、VPS35 -和LAMP1阳性区室的扩大，以及VPS35 - EEA1和VPS35 - LAMP1共定位的增加，表现为内溶酶体成熟延迟/崩溃(图4B ~4N和S5A)和内溶酶体循环障碍(图S5B和S5C)。有趣的是，稳定表达YENPTY基序的Tyr残基突变为Ala的m AICD突变体并没有诱导溶酶体缺陷，包括溶酶体Ca^{2 +}稳态失调(图4H - 4O)。这些数据支持了APP - CTF是APP的活性信号片段，其水平需要通过γ-分泌酶进行稳态控制的发现。

YENPTY是衔接蛋白结合的关键基序，如SorLA、Fe65、X11 / Mint和Dab1以及FYVE型含锌指的磷酸肌醇激酶PikFYVE，表明下游信号转导的多形性。观察到的部分效应可能源于信号缺陷型的m AICD明显的从内溶酶体定位重新定位到细胞表面(图4H )。然而，在表达PikFYVE显性阴性突变体的细胞或用PikFYVE抑制剂YM201636处理的WT细胞中观察到类似于在PSENd KO细胞中观察到的内溶酶体缺陷(图S5D )。同样，使用伊马替尼抑制PSENdKO细胞中的Abl激酶缓解了内溶酶体成熟的延迟，这从降低的VPS35 - LAMP1共定位和恢复的剂量依赖性溶酶体Ca^{2 +}含量中得到证明(图S5E ~S5I)。改善的分选和回收导致了VPS35阳性细胞器中APP - CTFs的显著减少(图S5G )，尽管这在LAMP1阳性的LE / Lys中没有观察到这种情况(图S5F )。总而言之，这表明抑制APP衍生片段的信号传导缓解了内溶酶体缺陷，主要是通过恢复货物的再循环来实现的。

图4：内溶酶体缺陷是由膜锚定的 APP 胞内结构域引起的

虽然作者已证明，长期γ-分泌酶抑制可导致内溶酶体Ca^{2 +}含量降低，这是内溶酶体稳态失调的根源，但上述数据表明，它可能源于膜结合的AICD片段的持续信号引起的。为了进一步研究这个问题，作者首先探讨了溶酶体Ca^{2 +}稳态失调的起源。与之前的报道相比，作者认为无法将这种缺陷与联系溶酶体Ca^{2 +}通道瞬时受体TRPML1的过度激活联系起来。首先，在3个独立的PSENd KO克隆中，用TRPML1激动剂MLSA1进行处理并没有发现通道的过度激活(图6A )。其次，作者构建了一个KI小鼠模型，其中TRMPL1用Ca^{2 +}传感器Gcamp6S内源性标记，并与作者的PSEN1KO小鼠模型杂交。来自PSEN1 KO / KO Gcamp6S- TRPML1 KI / KI胚胎的原代神经元在受到MLSA1刺激时，并没有表现出溶酶体Ca^{2 +}反应的增加，如之前报道的那样，而GPN引起的Ca^{2 +}反应与WT / WT相比仍然降低(图S6B )。

溶酶体Ca^{2 +}缺陷的另一个潜在来源可能来自内质网和溶酶体之间的通讯失败。作者我们评估了不同细胞系中内质网对溶酶体的 Ca²⁺ 补充情况（图 5A、S6C 和 S6D）。在没有细胞外 Ca²⁺ 的情况下，用 GPN 反复刺激 Fura2-AM 负载的细胞，使溶酶体 Ca²⁺ 排空，并在有细胞外 Ca²⁺ 的情况下交替出现“休息期”，使溶酶体重新密封并从内质网重新填充（图 S6C 和 S6D）。PSENd KO细胞的溶酶体Ca^{2 +}再充盈显著减少，当hPSEN1重新稳定表达或APP敲除时，溶酶体Ca^{2 +}再充盈得到恢复(图5A和S6C)。这些发现表明，内质网到溶酶体的Ca^{2 +}转移是通过LE / Lys - ER MCSs发生的。因此，作者接下来研究APP - CTFs是否在LE / Lys - ER MCSs内或附近发生干扰。作者对APP - βCTF ( C99 )或m AICD稳定挽救并共转染GFPSec61b (标记ER ;图5B - 5D、S6E和S6F)的PSENdKO和PSENdKO - APPKO细胞进行了超分辨Airyscan成像。APP和/或APP - CTFs通常聚集在LAMP1阳性的LE / Lys的膜上，并与GFP-Sec61b ⁺ ER膜紧密贴合，正如各自的线扫描所示(图5B ~5D)，表明它们定位在LE / Lys - ER MCSs中。APP免疫反应性与GFP - Sec61b不重叠，使得APP - CTFs从LE / Lys侧发挥其在MCSs中的作用。在表达mAICD的细胞中，在80 ~ 120 nm范围内观察到了类似MCSs的密切接触，这是MCSs的典型特征(图5D )。为了进一步验证这一点，作者通过过表达 VAPB 和 Stard3促进了 LE/Lys-ER MCSs 的形成，导致 APP/APP 相关片段与 Stard3 在 LE/Lys-ER MCSs 中显著共定位（图 S6G 和 S6H）。在DAPT处理的原代海马神经元中外源性表达Stard3同样导致APP - CTFs在与ER并列的Stard3阳性结构域中积累，强调了APP - CTFs的保守特征(图S6I )。为了进一步确认APP - CTFs对这些MCSs的定位，作者用低渗( 5 % DMEM水)溶液处理细胞，这导致细胞内隔室的快速空泡化，而不影响细胞器间的接触。细胞内大囊泡( LICVs )的形成使MCSs更加明显，便于共定位分析。低渗处理PSENdKO - APPKO细胞，转染mCherry - Sec61b和APP - YFP (图5E )或C99 - GFP (图5F )，导致APP阳性的LICVs与ER来源的LICVs接触，并且APP / APP - CTFs在这些接触位点频繁富集，与mCherry - Sec61b ⁺ LICVs (图5B和5C以及线扫描图)在80 - 120 nm范围内相似。这些数据表明APP - CTFs定位于LE / Lys-ER MCSs，它们可能调节ER到溶酶体的Ca^{2 +}转移。作为对照，PSENdKO和PSENdKO - APPKO细胞用HSP60的C99挽救的三重免疫染色没有显示与线粒体紧密的结合，这与MCSs类似(图5G和5H)。同样，用低渗培养基处理的细胞的活体成像显示APP -和MitoTracker阳性的LICVs (图5I和5J)之间有更大的距离，这与之前报道的APP - C99在线粒体相关膜( MAMs或ER – 线粒体MCSs)中的存在相矛盾。为了研究APP -βCTF ( C99 )积累是否是PSEN缺陷细胞中观察到的线粒体缺陷的原因，作者使用Seahorse代谢分析(图S6J - S6O)测试线粒体适应性。PSENdKO MEF细胞的最大呼吸和ATP产量显著降低，这些代谢异常在hPSEN1挽救的细胞中得到恢复，但在PSENdKOxAPPKO MEF细胞中没有恢复(图S6J - S6L)。关于氧消耗率( OCR )和基础呼吸，PSEN1的再表达部分恢复到WT MEF细胞的水平，而APP的敲除没有(图S6M和S6N)。只有备用呼吸能力( SRC )的不足被APP缺乏所挽救。总体而言，为了支持 APP-C99 缺乏对 ER-Mito MCS 的定位，这些数据支持作者的结论，即在 PSENdKO 细胞中，APP 表达对观察到的线粒体代谢缺陷没有显着贡献。

图5：APP-CTF 和 mAICD 诱导的溶酶体 Ca²⁺ 降低源于 LE/Lys-ER 接触改变

接下来，作者研究了APP - CTFs定位的增加是否影响LE / Lys-ER MCS的形态。通过共表达HRP-myc-KDEL，然后用DAB处理，促进了TEM对ER的可视化。首先，PSENdKO细胞显示出更多的电子透明囊泡(图6A中红色星号;另见无关PSENd KO细胞的图S3A)，这可能反映了MVBs的成熟延迟。正如预期的那样，这种表型在hPSEN1挽救的PSENdKO和PSENdKO-APPKO细胞中消失，但在mAICD稳定挽救的PSENdKO-APPKO细胞中重新出现(图6A )。而PSENdKO和PSENdKOAPPKO - mAICD细胞的HRP反应内质网通常表现出更大的肿胀，此外，许多扩大的内质网与LE / MVBs的接触明显，有时在很大程度上包裹了它们(图6A )。在PSENdKO中重新引入hPSEN1或在此处耗竭APP可显著缩短长度，表明MCSs的正常化(见图6A中的量化)。

作者进一步推论，ER与LE / Lys的接触扩大也可能影响LE / Lys的其他方面，包括运动性。为了验证这一点，作者使用了结构化照明显微镜( SIM )。Zeiss Elyra - 7)，并比较了LysoTracker标记的酸性细胞器在不同细胞系中的动力学。使用PALMtracer (参见STAR方法)追踪单个细胞器并量化时间相关均方位移( MSD )的变化。这种方法可以区分不同类型的运动和随机运动。与观察到的扩大的LE / Lys - ER接触一致，只有积累或表达膜结合的AICD片段(无论是CTFs还是mAICD)的细胞显示不动轨迹的比例显著增加，类似于活动能力较低的细胞器(图6B和6E)。与之一致的是，我们观察到MSD和扩散系数的降低(图6C和6D)。运动能力的下降与LysoTracker Red标记的细胞器在内质网上的滞留时间延长有关，通过这些细胞器较高的共定位表明(图6F和6G ;视频S1 ~S5)。

图6：膜结合的 APP 片段影响 LE/Lys-ER MCS 形态和 LE/Lys 动力学

至此，作者发现PSEN缺陷细胞的溶酶体C^{a2 +}含量降低可能与APP - CTFs或mAICD与改变的LE / Lys - ER MCSs聚集有关。此外，溶酶体Ca^{2 +}减少和胆固醇增加是长期抑制γ-分泌酶时内溶酶体崩溃前的两个主要事件。因此，作者首先推断，阻止溶酶体Ca^{2 +}释放可能阻止下游的内溶酶体缺陷。LE / Lys含有不同的Ca^{2 +}转运体，包括TRPML1和TPC2，用TPC2抑制剂NED - 19 ( 400 nM )处理PSENdKO MEF细胞或PSEN1^-/-海马神经元细胞，以类似于WT细胞的方式挽救了LE / Lys Ca^{2 +}释放(图S7I和S7J)。NED - 19还减少了LAMP1和VPS35阳性区域(图S7A、S7B、S7D、S7E)，并减少了溶酶体塌陷，表现为LAMP1与EEA1和VPS35的共定位降低，尽管后者并不显著(图S7F和S7G)。由于作者发现LE / Lys中APP / APP-CTF的增加足以诱导内溶酶体的死亡，NED - 19未能减少其在LAMP1阳性隔室中的定位(图S7H )可能解释了NED - 19未能充分挽救LE / Lys Ca^{2 +}储存减少的更多下游效应。除了溶酶体Ca^{2 +}功能障碍外，PSEN1KO细胞还与NPC1KO细胞共享LE / Lys中的胆固醇积累，尽管程度较轻(图S8A )。因此，作者想知道在PSEN缺陷的细胞中，抵消胆固醇的增加是否可以减轻内溶酶体的死亡。通过filipin染色显示，APP - CTFs或mAICD (图7A和7B)挽救的PSENdKO和PSENdKO - APPKO细胞中游离胆固醇蓄积在LAMP1区。在这些细胞器中，filipin与APP - CTFs和mAICD存在明显的共定位(图7A ~ 7D)，在PSENdKO背景下敲除APP或重新表达突变型mAICD使其积累恢复到WT水平。因此，作者想知道减轻LE / Lys中胆固醇的负荷是否可以纠正溶酶体Ca^{2 +}缺陷。作者用OSW – 1（OSBP和ORP4L的抑制剂）处理PSENdKO细胞，抵消胆固醇从内质网到溶酶体的隔离。处理并没有降低溶酶体胆固醇染色，也没有挽救PSENd KO细胞的溶酶体Ca^{2 +}功能障碍(图S8B和S8C)。这表明LE / Lys中积累的胆固醇并不来源于ER。或者，作者通过过表达NPC1或用HPγCD药物处理通过调节ER -溶酶体MCSs诱导溶酶体胆固醇外流(图S8D ~ S8Q)，降低细胞内游离胆固醇，增强自噬活性。NPC1过表达和HPγCD处理均显著降低了PSENdKO细胞中LAMP1阳性的LE / Lys中膜结合APP片段的积累(图S8D和S8E ,也可见于图S8F , S8K , S8L和S8O)，并完全恢复了溶酶体Ca^{2 +}含量(图7E )。值得注意的是，这些处理也部分恢复了内溶酶体的成熟，表现为EEA1的面积减少，VPS35与EEA1或LAMP1的共定位减少(图S8H ~ S8J , S8L , S8M , S8P , S8Q)。总之，促进胆固醇从LE /溶酶体流出，而不是从ER流出的处理，缓解了PSEN缺陷细胞中观察到的溶酶体Ca^{2 +}和内溶酶体缺陷。

图7：胆固醇排出纠正溶酶体 Ca²⁺ 缺陷

      本研究中，作者阐明了在 PSEN 缺陷细胞和神经元中，或在γ-分泌酶抑制时，APP-CTFs 水平的升高是如何导致内溶酶体死亡的。作者的数据在APP处理和通过内质网Ca^{2 +}再充盈途径维持溶酶体Ca^{2 +}稳态之间的建立了功能联系。此外，APP-CTFs聚集在LE / Lys膜上，靠近MCSs或与ER聚集在MCSs内。在PSEN /γ-分泌酶缺陷或DAPT处理的细胞中，APP-CTFs的异常积累导致了APP胞浆区信号级联的延长，破坏了细胞器间的通讯，并损害了ER到LE / Lys Ca^{2 +}的再充盈。作者认为APP – CTFs在LE / Lys上的蛋白水解对于维持LE / Lys的稳态至关重要。值得注意的是，在非神经元细胞和原代海马神经元中都获得了类似的数据，强调了保守机制。作者的发现为APP介导的信号传导提供了另一种见解，挑战了先前关于APP - CTFs的功能和定位的概念。

机制模式图

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Bretou M, Sannerud R, Escamilla-Ayala A, Leroy T, Vrancx C, Van Acker ZP, Perdok A, Vermeire W, Vorsters I, Van Keymolen S, Maxson M, Pavie B, Wierda K, Eskelinen EL, Annaert W. Accumulation of APP C-terminal fragments causes endolysosomal dysfunction through the dysregulation of late endosome to lysosome-ER contact sites. Dev Cell. 2024 Jun 17;59(12):1571-1592.e9.