罗哌卡因通过PI3K/Akt/mTOR通路对先兆子痫大鼠氧化应激及炎症反应的影响

1南通大学附属海安医院麻醉科，南通 226600；2南通大学附属海安医院康复科，南通 226600

【论著】

本研究探究罗哌卡因对先兆子痫炎症反应及氧化应激损伤的影响及其作用机制。 

1.1　研究动物

84只SPF级雌性SD大鼠，孕12 d，体重230~250 g。所有大鼠在温度为23 ℃、湿度为50%~55%、明暗光循环12 h的环境下饲养，自由饮水与摄食。

1.2　主要试剂及仪器

罗哌卡因注射液，左旋硝基精氨酸甲酯（L‑NAME），硫酸镁，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂BKM120，2%戊巴比妥钠，4%多聚甲醛，苏木精‑伊红（H‑E）染色液，大鼠白细胞介素（IL）‑6、IL‑1β、肿瘤坏死因子α（TNF‑α）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH‑px）、丙二醛（MDA）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，兔源一抗磷酸化PI3K（p‑PI3K）、磷酸化Akt（p‑Akt）、磷酸化mTOR（p‑mTOR）、PI3K、Akt、mTOR、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶（GAPDH）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗。无创血压仪，光学显微镜，酶标仪，蛋白凝胶成像系统。

1.3　动物分组及处理

按随机数字表法将84只大鼠分为对照组、模型组、罗哌卡因低剂量组、罗哌卡因高剂量组、硫酸镁组、BKM120组、罗哌卡因高剂量+BKM120组，每组12只。除对照组外，其他各组大鼠在孕13~19 d每天腹腔注射1次200 mg/kg L‑NAME构建先兆子痫大鼠模型，造模阳性率为100%；对照组大鼠腹腔注射等容积生理盐水。所有大鼠在孕13~19 d根据分组每天1次通过鞘内注射及胃内灌注分别给予不同药物处理。罗哌卡因低剂量组大鼠鞘内注射40 μl 0.25%罗哌卡因，灌胃等量的生理盐水；罗哌卡因高剂量组大鼠鞘内注射40 μl 0.75%罗哌卡因，灌胃等量生理盐水；硫酸镁组大鼠灌胃30 mg/kg硫酸镁，鞘内注射等量的生理盐水；BKM120组大鼠灌胃40 mg/kg BKM120，鞘内注射等量的生理盐水；罗哌卡因高剂量+BKM120组大鼠鞘内注射40 μl 0.75%罗哌卡因，灌胃40 mg/kg BKM120。

1.4　大鼠舒张压、收缩压的检测

末次给药处理24 h后，利用大鼠无创血压仪测量大鼠尾动脉舒张压、收缩压。

1.5　标本收集

将所有大鼠置于代谢笼中，收集大鼠24 h（当日早上7点到次日早上7点)尿液检测24 h尿蛋白含量；24 h尿液收集后，2%戊巴比妥钠麻醉并处死大鼠，取出大鼠的胎盘组织，将胎盘组织分为两部分（每部分包含各组6只大鼠的胎盘组织），一部分用于H‑E染色，另一部分用于ELISA和免疫印迹法（Western blot）实验。

1.6　大鼠24 h尿蛋白含量的检测

磺基水杨酸比浊法测定大鼠24 h尿蛋白含量。

1.7　H‑E染色检测大鼠胎盘组织病理变化

将胎盘组织在4%多聚甲醛中固定过夜，包埋在石蜡中，5 μm切片后进行H‑E染色。光学显微镜观察胎盘组织病理变化。

1.8　ELISA法检测大鼠胎盘组织中IL‑6、IL‑1β、TNF‑α水平，SOD、GSH‑px活性及MDA含量

按试剂盒说明书检测大鼠胎盘组织中：IL‑6、IL‑1β、TNF‑α水平，SOD、GSH‑px活性，MDA含量。

1.9　Western blot检测大鼠胎盘组织中p‑PI3K、p‑Akt、p‑mTOR水平

放射免疫沉淀试验裂解液提取胎盘组织匀浆总蛋白，将40 μg蛋白样品通过电泳分离，转移到聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂牛奶封闭膜后，在4 °C下将膜与一抗p‑PI3K（1∶2 000）、p‑Akt（1∶3 000）、p‑mTOR（1∶3 000）、PI3K（1∶2 000）、Akt（1∶3 000）、mTOR（1∶2 000）、GAPDH（1∶4 000）孵育过夜。第2天，将膜与HRP耦联的二抗（1∶5 000）在室温下孵育2 h。使用增强型化学发光试剂可视化蛋白，使用Image J软件获得目的蛋白灰度值。以p‑PI3K/PI3K、p‑Akt/Akt、p‑mTOR/mTOR表示目的蛋白磷酸化水平。

2.1　舒张压、收缩压、24 h尿蛋白含量比较

与对照组比较，模型组舒张压、收缩压、24 h尿蛋白含量较高（均P<0.05）。与模型组比较，罗哌卡因低剂量组、罗哌卡因高剂量组、硫酸镁组舒张压、收缩压、24 h尿蛋白含量较低（均P<0.05），BKM120组舒张压、收缩压、24 h尿蛋白含量较高（均P<0.05）。与罗哌卡因低剂量组比较，罗哌卡因高剂量组、硫酸镁组舒张压、收缩压、24 h尿蛋白含量较低（均P<0.05）。与罗哌卡因高剂量组比较，罗哌卡因高剂量+BKM120组舒张压、收缩压、24 h尿蛋白含量较高（均P<0.05）。罗哌卡因高剂量组与硫酸镁组各指标差异无统计学意义（均P>0.05）。见图1。

2.2　胎盘组织病理变化比较

对照组胎盘组织滋养层细胞正常，排列有序。与对照组比较，模型组胎盘组织滋养层细胞排列紊乱，且有大量炎症细胞浸润。与模型组比较，罗哌卡因低剂量组、罗哌卡因高剂量组、硫酸镁组胎盘组织滋养层细胞排列紊乱程度较低，炎症细胞浸润较少。与模型组比较，BKM120组胎盘组织滋养层细胞排列更加紊乱，炎症细胞浸润增多。与罗哌卡因高剂量组比较，罗哌卡因高剂量+BKM120组胎盘组织滋养层细胞排列紊乱程度较高，炎症细胞浸润明显。见图2。

2.3　胎盘组织中IL‑6、IL‑1β、TNF‑α水平比较

与对照组比较，模型组胎盘组织中IL‑6、IL‑1β、TNF‑α水平较高（均P<0.05）。与模型组比较，罗哌卡因低剂量组、罗哌卡因高剂量组、硫酸镁组胎盘组织中IL‑6、IL‑1β、TNF‑α水平较低（均P<0.05），BKM120组胎盘组织中IL‑6、IL‑1β、TNF‑α水平较高（均P<0.05）。与罗哌卡因低剂量组比较，罗哌卡因高剂量组、硫酸镁组胎盘组织中IL‑6、IL‑1β、TNF‑α水平较低（均P<0.05）。与罗哌卡因高剂量组比较，罗哌卡因高剂量+BKM120组胎盘组织中IL‑6、IL‑1β、TNF‑α水平较高（均P<0.05）。罗哌卡因高剂量组与硫酸镁组各指标差异无统计学意义（均P>0.05）。见图3。

2.4　胎盘组织中SOD、GSH‑px活性及MDA含量比较

与对照组比较，模型组胎盘组织中SOD、GSH‑px活性降低，MDA含量较高（均P<0.05）。与模型组比较：罗哌卡因低剂量组、罗哌卡因高剂量组、硫酸镁组胎盘组织中SOD、GSH‑px活性较高，MDA含量较低（均P<0.05），BKM120组胎盘组织中SOD、GSH‑px活性较低，MDA含量较高（均P<0.05）。与罗哌卡因低剂量组比较，罗哌卡因高剂量组、硫酸镁组胎盘组织中SOD、GSH‑px活性较高，MDA含量较低（均P<0.05）。与罗哌卡因高剂量组比较，罗哌卡因高剂量+BKM120组胎盘组织中SOD、GSH‑px活性较低，MDA含量较高（均P<0.05）。罗哌卡因高剂量组与硫酸镁组各指标组间差异无统计学意义（均P>0.05）。见图4。

2.5　胎盘组织中PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白水平比较

与对照组比较，模型组胎盘组织中p‑PI3K、p‑Akt、p‑mTOR水平较低（均P<0.05）。与模型组比较，罗哌卡因低剂量组、罗哌卡因高剂量组、硫酸镁组胎盘组织中p‑PI3K、p‑Akt、p‑mTOR水平较高（均P<0.05），BKM120组胎盘组织中p‑PI3K、p‑Akt、p‑mTOR水平较低（均P<0.05）。与罗哌卡因低剂量组比较，罗哌卡因高剂量组、硫酸镁组胎盘组织中p‑PI3K、p‑Akt、p‑mTOR水平较高（均P<0.05）。与罗哌卡因高剂量组比较，罗哌卡因高剂量+BKM120组胎盘组织中p‑PI3K、p‑Akt、p‑mTOR水平较低（均P<0.05）。罗哌卡因高剂量组与硫酸镁组各指标差异无统计学意义（均P>0.05）。见图5。

本研究显示，与对照组比较，模型组大鼠IL‑6、IL‑1β、TNF‑α水平及MDA含量升高，SOD、GSH‑px活性降低，表明胎盘组织中的炎症反应及氧化应激参与了大鼠先兆子痫的发展。因此，抑制炎症反应及氧化应激可能是治疗先兆子痫的潜在有效策略。

本研究参考文献及预实验，确定处理先兆子痫大鼠的罗哌卡因低、高剂量，结果显示，低、高剂量罗哌卡因均可抑制先兆子痫大鼠炎症反应及氧化应激，且罗哌卡因剂量越高，抑制作用越明显。硫酸镁是临床上常用于治疗先兆子痫的药物，本研究以该药物为阳性药物，结果显示，硫酸镁与高剂量罗哌卡因对先兆子痫大鼠炎症反应及氧化应激的抑制作用差异无统计学意义，提示罗哌卡因可能成为改善先兆子痫的潜在有效药物。

本研究显示，与模型组比较，BKM120组大鼠胎盘组织中p‑PI3K、p‑Akt、p‑mTOR水平降低，炎症反应及氧化应激增强，BKM120为PI3K抑制剂，表明在先兆子痫过程中PI3K/Akt/mTOR通路处于抑制状态。本研究还发现，罗哌卡因可促进先兆子痫大鼠胎盘组织中p‑PI3K、p‑Akt、p‑mTOR表达，且罗哌卡因剂量越高，作用越明显。推测罗哌卡因可能通过激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制先兆子痫大鼠炎症反应及氧化应激。本研究在高剂量罗哌卡因作用的基础上添加PI3K抑制剂BKM120来干预先兆子痫大鼠，结果显示，BKM120减弱了高剂量罗哌卡因对先兆子痫大鼠炎症反应及氧化应激的抑制作用，证实了推测的合理性。

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