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mRNA疫苗的发展彻底改变了疫苗领域的前景，为针对一系列疾病的mRNA药物开发提供了新的可能性。吸入式mRNA传递作为一种治疗各种肺部疾病的方法，包括囊性纤维化和癌症，显示出巨大的潜力。特别是，吸入式mRNA在触发粘膜免疫反应方面的能力，作为对抗呼吸道病原体的第一道防线，通过控制其增殖和传播，具有特别引人注目的应用前景。然而，LNP在雾化过程中的不稳定性，导致其在气雾化过程中的聚集、解体和mRNA的过早泄漏，是实现高效吸入式mRNA传递的主要障碍。为了解决这一挑战，中国科学院化学研究所吕雪光、北京大学药学院苗蕾和大连理工大学林佳奇团队开发了一种电荷辅助稳定（CAS）策略，通过使用肽脂质偶联物优化表面电荷，在LNP之间引入静电力排斥增强了其胶体稳定性，所制备的CAS-LNP 在雾化过程中表现出卓越的稳定性，从而在小鼠、狗和猪中实现高效的肺 mRNA 递送。
mRNA由于磷酸二酯的负电荷，主要通过与带正电的可离子化脂质相互作用被包裹在LNPs中。引入带负电的脂质需考虑其电负性和亲水性，可能会干扰mRNA的结合，并影响LNP的稳定性。他们选择氨基酸作为负电荷脂质的来源，设计了由天冬氨酸、丝氨酸和半胱氨酸组成的peptide-DSSC，以增强亲水性和调节电荷。
通过将DSSC与DOPE结合，成功合成了带负电荷的两亲性寡肽-辅助脂质复合物，并利用该复合物制备了改进的LNP (CAS-LNP)。结果显示，CAS-LNP的组装、mRNA包封效率以及稳定性与传统LNP（SM102-LNP）相似，但表面电位随着DSSC-DOPE量的增加而降低，证明了其有效整合。吸入 CAS-LNP 的稳定性和 mRNA 递送效果
随后评估了 CAS-LNP 在高剪切力下的胶体稳定性。将 LNP 分散在 0.3 × PBS 中以减轻高离子浓度对 CAS-LNP 静电排斥的影响，用 Aerogen Solo 雾化 SM102-LNP 和 CAS-LNP 溶液。测量雾化前后封装的 mRNA 量，发现约 17% 的 SM102-LNP 保持完整（图1i），表明显著崩解和 mRNA 泄漏。而 CAS-LNP 显示出更好的稳定性，表面电荷的增加有效增强了胶体稳定性。尽管 10% DSSC-DOPE 的 CAS-LNP 表面电位最低，但其稳定性低于 2.5% CAS-LNP。DSPC 提升了 LNP 的稳定性，而 2.5% CAS-LNP 在优化的 DSPC 和 DSSC-DOPE 比例中表现最佳。图2 雾化后 CAS-LNP 的稳定性和 mRNA 递送效率进一步研究显示，CAS-LNP 在小鼠中的 mRNA 递送效果优于 SM102-LNP。雾化后，CAS-LNP 的光强度在肺部区域更高，2.5% CAS-LNP 的 mRNA 表达较 SM102-LNP 增加了 6.9 倍，突显了其增强的胶体稳定性与 mRNA 递送效率之间的直接相关性。为了比较雾化溶液的口咽抽吸与吸入方法，并验证 CAS-LNP 在吸入后增强的 mRNA 输送，如图2f，他们将雾化器连接到定制装置，同时让三只小鼠吸入 SM102-LNP 或含有 100 µg mFluc 的 2.5% CAS-LNP。24 小时后切除小鼠肺部，IVIS 成像结果表明，CAS-LNP 的 mRNA 表达比 SM102-LNP 增加了 4 倍（图2g，h），验证了其增强的递送效果。为了排除 mRNA 输送效率提升仅因 LNP 配方变化的可能性，他们还注射了雾化前的两种 LNP。结果如上图所示，尽管 2.5% CAS-LNP 和 SM102-LNP 具有相似的生物分布模式，但CAS-LNP 的 mRNA 表达低于 SM102-LNP，暗示 DSSC-DOPE 对后者产生负面影响。此外，体外研究显示，2.5% CAS-LNP 的细胞摄取比 SM102-LNP 低 2.4 倍，可能与其更多的负电荷有关。为了评估 CAS 策略的普适性，他们还将其应用于已经获批的LNP递送系统。加入 2.5% DSSC-DOPE 制备的 MC3-CAS-LNP 和 ALC0315-CAS-LNP 表面电位降低。电位测量显示，MC3-LNP 和 ALC0315-LNP 的表面电荷接近中性，而 CAS-LNP 的表面电位有所降低。
随后评估了其在雾化过程中的稳定性和体内 mRNA 递送效能，结果显示 MC3-CAS-LNP 和 ALC0315-CAS-LNP 的稳定性和 mRNA 表达显著增强，验证了 CAS 策略的有效性。此外，与其他吸入制剂比较，CAS-LNP 显示出显著更高的 mRNA 递送效果，尽管这些吸入制剂使用了带正电荷的 DOTAP 脂质，说明 DOTAP 可能通过尚未阐明的机制改善 LNP 的肺部输送。此外，他们还研究了CAS-LNP在大型动物中的mRNA递送效果，以期与人类的呼吸系统相似。比较了巴马小型猪在吸入SM102-LNP和CAS-LNP后的mRNA表达效率。猪在雾化后接受0.3 mg/kg的mFluc LNPs，三小时后进行荧光素腹膜注射并分离气管和肺进行生物发光成像。结果显示，CAS-LNP治疗组的mFluc表达高于SM102-LNP组。此外，CAS-LNP也成功转染了比格犬的肺。结果表明，CAS-LNP能够在小鼠、狗和猪等不同物种中有效递送mRNA，显示出其临床转化的潜力。CAS-LNPs在雾化后需穿透粘液层以实现mRNA表达。实验中，他们将Cy5标记的增强型绿色荧光蛋白mRNA封装在CAS-LNP和SM102-LNP中，并雾化给小鼠。结果显示，CAS-LNP处理的小鼠在肺实质中显示出明显的Cy5和EGFP荧光强于SM102-LNP，表明CAS-LNP能够有效穿透粘液层。相比之下，SM102-LNP组的信号较弱，可能由于其mRNA泄漏使之难以穿透粘液层。
图5 吸入的 CAS-LNP 将 mRNA 输送至小鼠的特定细胞随后进一步比较了吸入的CAS-LNP和静脉注射的IV-LNP对特定肺细胞亚型的转染，发现吸入CAS-LNP在免疫细胞中的表达最高，适合用作mRNA疫苗递送，而IV-LNP则在内皮细胞中特异性表现出mRNA表达。两者显示不同的转染谱，强调了药物给付途径在选择LNP配方时的重要性。接下来，通过将卵清蛋白编码的 mRNA 封装在 CAS-LNP 和 SM102-LNP 中，进行癌症疫苗的概念验证。结果显示，CAS-LNP 在小鼠中显著提高了 OVA 特异性 CD8 + T 细胞和脾脏中产生 IFN-γ 的细胞的比例。此外，CAS-LNP 显著减少了肿瘤转移灶的数量和肺部肿瘤的相对面积，展现了其作为预防性癌症疫苗的有效性。
在治疗性疫苗方面，针对 B16F10 转移性模型的研究显示，使用 CAS-LNP 封装的 GP70 mRNA 也能有效延长小鼠生存期并改善 M1/M2 巨噬细胞比率，表明其可以有效刺激促炎巨噬细胞反应，并作为一种治疗性疫苗有效抑制肿瘤转移。虽然像 B16F10 这样的临床前模型可能无法完全反映转移性肺癌的复杂性，但展现了吸入 mRNA 疫苗在治疗中的潜力。此外，由于 mRNA 能够编码多种肿瘤抗原，CAS-LNP 有望成为治疗各种肺癌的有效平台。未来的研究应重点探讨其在更具临床相关性的模型中的疗效和安全性。尽管临床前模型的局限性仍需克服，CAS-LNP 在治疗性肺癌疫苗方面展示了良好前景，未来值得进一步研究。
