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北京大学第三医院 魏天娇 翻译，王海宁 审校
Source：Tianjiao Wei, et al. Diabetes. 2023 May 1;72(5):599-610.
doi: 10.2337/db22-0784.
分泌胰高糖素的胰岛α细胞功能障碍参与了糖尿病的发生和发展，胰高糖素受体（glucagon receptor，GCGR）阻滞被认为是糖尿病治疗的新策略。GCGR阻滞可上调胰高糖素和胰高糖素样肽-1（glucagonlikepeptide 1，GLP-1）分泌，值得注意的是，GCGR阻滞还可促进糖尿病小鼠β细胞再生。本研究旨在阐明由胰高糖素和（或）GLP-1激活的GLP-1受体（GLP-1 receptor，GLP-1R）信号通路在GCGR阻滞诱导的β细胞再生中的作用。我们发现，在db/db小鼠和野生型（wild-type，WT）或Flox/cre基因型的1型糖尿病小鼠中，GCGR单克隆抗体（简称单抗）可以改善血糖控制、上调血浆胰岛素水平并增加β细胞面积。值得注意的是，应用exendin 9-39（Ex9）或Glp1r基因敲除以全身或胰腺特异性阻断GLP-1R信号通路可削弱GCGR单抗的上述作用。此外，应用胰高糖素中和抗体阻止胰高糖素激活GLP-1R同样可以削弱GCGR单抗促进胰岛素分泌和β细胞再生的作用。在正常小鼠和db/db小鼠离体培养的原代胰岛中，GCGR单抗促进胰岛素释放并上调β细胞特异性标志物表达的作用可被胰高糖素中和抗体、GLP-1R拮抗剂Ex9及胰腺特异性Glp1r敲除削弱。这些结果表明，胰高糖素–GLP-1R通路激活参与了GCGR阻滞诱导的糖尿病小鼠β细胞再生。
亮点
胰高糖素受体（GCGR）阻滞可促进1型、2型糖尿病小鼠和血糖正常的非人类灵长类动物β细胞再生。胰高糖素和胰高糖素样肽-1（GLP-1）可以激活GLP-1受体（GLP-1R），且两种激素水平在GCGR阻滞后显著上调。
我们探究了胰高糖素和/（或）GLP-1激活的GLP-1R信号通路是否参与GCGR阻滞诱导的β细胞再生。
我们发现，阻断胰高糖素–GLP-1R信号通路削弱了GCGR单克隆抗体促进糖尿病小鼠胰岛素分泌和β 细胞再生的作用。
我们的研究发现了β细胞再生的新机制，并揭示了α细胞与β细胞间对话在调节β细胞总量中的作用。
功能性胰岛β细胞总量减少是糖尿病发生和发展的原因[1]。胰岛α细胞分泌的胰高糖素主要作用于胰高糖素受体（glucagon receptor，GCGR）。在调节血糖代谢方面，胰高糖素与胰岛素的作用相反，因而得到越来越多的关注[2]。胰高糖素分泌过多常见于1型糖尿病和2型糖尿病患者[3]。因此，GCGR已成为糖尿病治疗的潜在靶点。在1型糖尿病（type1 diabetes，T1D）或2型糖尿病（type 2 diabetes，T2D）的动物和人群中，通过不同方法（包括基因敲除[4]、反义寡核苷酸[5]、小分子拮抗剂[6] 和抗体[7,8]）阻滞GCGR可以改善血糖控制。
尽管胰高糖素作用的主要靶点是肝脏，胰高糖素同样可以作用于β细胞并参与调控胰岛素分泌[9-13]。GCGR阻滞可促进T1D、T2D小鼠[7,14-16]和血糖正常的非人类灵长类动物[17]β细胞再生（指通过β细胞增殖、β细胞再分化、α细胞向β细胞转分化、前体细胞来源β细胞新生途径增加β细胞总量）。这一有益作用可能是由胰高糖素样肽-1（glucagon-likepeptie-1，GLP-1）介导的，因为GCGR阻滞可大幅增加血浆GLP-1水平和肠道GLP-1含量[18]。然而，GLP-1可立即被肠道局部和循环中广泛存在的二肽基肽酶-4灭活并通过肾脏从循环中迅速清除[19,20]。因此，肠道L细胞来源的GLP-1可能难以对β细胞发挥作用。α细胞同样具有分泌GLP-1的能力[21,22]。GCGR阻滞能否促进α细胞来源GLP-1的分泌，以及其是否参与β细胞再生调节仍有待阐明。
GLP-1通过激活GLP-1受体（GLP-1 receptor，GLP-1R）对β细胞发挥保护作用[20]。值得注意的是，胰高糖素同样能够激活GLP-1R[9,13,23,24]。当胰高糖素–GCGR信号通路被阻断时，机体往往出现高胰高糖素血症和GLP-1水平升高[25,26]，这使得阐明哪种激素能够激活GLP-1R、以及激活的GLP-1R是否参与β细胞再生的问题变得复杂。
在本研究中，我们使用人源性GCGR单克隆抗体（以下简称单抗）REMD 2.59特异性阻滞GCGR，并检测其对db/db小鼠（T2D模型）和链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的T1D小鼠β细胞再生的影响。首先，我们证实了GCGR单抗可以上调循环和胰腺中胰高糖素和GLP-1水平。随后，通过应用GLP-1R拮抗剂exendin 9-39（Ex9）、全身或胰腺特异性Glp1r敲除小鼠，我们确定了GLP-1R信号通路是否参与GCGR单抗诱导的β细胞再生。胰高糖素中和抗体（neutralizing antibody，nAb）GLU-001可与胰高糖素结合，在GCGR单抗干预的情况下，胰高糖素中和抗体可阻止胰高糖素与GLP-1R结合。接下来，我们应用胰高糖素中和抗体GLU-001探究了胰高糖素–GLP-1R信号通路是否参与这一过程。此外，我们阐明了GCGR单抗能否促进胰岛来源的GLP-1生成，并确定了胰高糖素–GLP-1R信号通路参与GCGR单抗对正常小鼠和糖尿病小鼠原代胰岛β细胞功能和表型的调控。我们的研究为理解胰高糖素–GLP-1R信号通路提供了新的见解，并揭示了GCGR阻滞诱导β细胞再生的新机制。
所有动物实验均经北京大学实验动物福利伦理委员会批准。雄性db/db小鼠（8周龄） 分别给予IgG、GCGR单抗、Ex9或GCGR单抗联合Ex9干预4周。每周通过腹腔注射给予GCGR单抗REMD2.59（5 mg/kg；REMD Biotherapeutics，Camarillo，CA）和IgG（5 mg/kg，作为对照）。采用微渗透泵（ALZET，Cupertino，CA）给予Ex9（50 nmol/kg/天；Bachem，Bubendorf，Switzerland）或生理盐水[27]。
8~12周龄的雄性和雌性全身Glp1r敲除（Glp1r-/-）小鼠（补充材料图1A和B）和野生型（Wild-type，WT）Glp1r+/+同窝小鼠，以及雄性胰腺特异性Glp1r敲除（Glp1rpan-/-）小鼠、Glp1r-flox或Pdx1-Cre（Flox/Cre）同窝对照小鼠（补充材料图1C和D）注射STZ（125 mg/kg；MilliporeSigma，St. Louis，MO） 以诱导T1D小鼠模型。糖尿病小鼠分别给予5 mg/kgGCGR单抗或IgG干预4周。
STZ诱导的T1D雄性C57BL/6J小鼠（12周龄）给予5 mg/kg IgG或GCGR单抗，联合4 mg/kg A-TNP（ 胰高糖素中和抗体对照） 或胰高糖素中和抗体GLU-001（Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark）干预4周。GLU-001 和A-TNP 每天腹腔注射给药[28]。
采用OneTouch Ultra血糖仪（LifeScan，Milpitas，CA）检测尾静脉样本的血糖水平。小鼠在过夜空腹后进行葡萄糖耐量试验。腹腔注射2 g/kg葡萄糖后，检测基线、30分钟、60分钟和120分钟时的血糖水平。
胰腺组织用10%（v/v）中性福尔马林固定，石蜡包埋。切片（5 μm 厚）进行脱蜡、水合、山羊血清封闭、一抗4℃过夜孵育、二抗室温孵育1小时，然后用DAPI进行核染色。使用Leica TCS SP8共聚焦荧光显微镜（Leica Microsystems，Wetzlar, Germany）或自动数字切片扫描仪（Pannoramic MIDI，3DHISTECH，Budapest，Hungary）进行荧光成像。抗体已在补充材料表1中总结。
选取每组3只小鼠，每个小鼠胰腺组织3~4张切片（可以涵盖整个胰腺组织）进行成像以进行细胞定量。应用Fiji软件（National Institutes of Health，Bethesda，MD）对阳性染色细胞的面积进行分析[29]。将细胞数≤10个的胰岛簇定义为小胰岛，以提示胰岛新生[30]。
按照既往报道分离小鼠原代胰岛[31]。在高糖（30 mmol/L） 培养条件下，8周龄雄性正常C57BL/6J小鼠和db/db小鼠的胰岛在不经其它处理、经Ex9（200 nmol/L）或经胰高糖素中和抗体（10 mg/L）处理的情况下， 分别给予1000 nmol/LGCGR单抗或IgG干预24小时。8周龄雄性Glp1rpan-/-小鼠的胰岛分别给予1000 nmol/L GCGR单抗或IgG干预24小时。
补充材料表1总结了检测胰岛素、C肽、胰高糖素和活性GLP-1的ELISA试剂盒。胰腺裂解液和胰岛培养上清中的激素水平分别用胰腺裂解液和培养胰岛的蛋白含量标化。
应用Trizol（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）提取总RNA，应用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific）合成cDNA。应用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（Toyobo Co.，LTD.，Osaka，Japan）在QuantStudio 5实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）上进行定量PCR。选取Actb基因进行标化、应用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达量。引物序列汇总见补充材料表2。
正态分布数据以平均值±标准误表示。三组或更多组间采用单因素或双因素方差分析，组间比较视情况采用Dunnett T3多重比较检验、Tukey多重比较检验或Bonferroni多重比较检验；两组间数据采用非配对Student t检验（双尾）。非正态分布数据则以中位数（四分位数间距）表示。三组或更多组间比较采用Kruskal-Wallis检验，组间比较采用Dunn多重比较检验，两组间数据采用Mann-Whitney检验（双尾）。P<0.05视为有统计学意义。使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software，San Diego，CA）进行统计学分析。
本研究产生和分析的数据集和资源可根据合理的要求从通讯作者处获得。
在db/db小鼠和T1D小鼠中，GCGR单抗组和IgG组的体重在4周干预期间没有显著差异（补充材料图2A和B）。与基线或IgG对照相比，GCGR单抗显著降低两种糖尿病小鼠的空腹和随机血糖水平（图1A和B，补充材料图2C和D）。GCGR单抗使db/db小鼠和T1D小鼠的血浆胰岛素水平分别增加到2.04倍和1.68倍（图1C和D）。在两种糖尿病小鼠模型中，GCGR单抗组β细胞面积均增加到约3倍（图1E和F，补充材料图3），提示β细胞发生再生。在两种糖尿病小鼠模型中，GCGR单抗干预增加α细胞面积（补充材料图2E和F，补充材料图3)、上调血浆胰高糖素（约11倍）、血浆GLP-1（db/db小鼠：12.81倍；T1D小鼠：3.60倍）和胰腺GLP-1（约5~6倍）水平（图1G–L），提示α细胞数量和功能发生了变化。这些结果表明，增加的胰高糖素和GLP-1可能参与GCGR单抗诱导的β细胞再生。
图1-GCGR单抗促进T2D和T1D小鼠β细胞再生，并上调血浆和胰腺的胰高糖素和GLP-1水平。雄性db/db小鼠（8周龄）被用作T2D模型小鼠。雄性C57BL/6J小鼠（12周龄）注射STZ 以诱导T1D模型。小鼠每周给予IgG（5 mg/kg，作为对照）或GCGR单抗（5 mg/kg）干预4周。A、C、E、G、I和K：db/db小鼠的指标。B、D、F、H、J和L：T1D小鼠的指标。A和B：空腹血糖。C和D：血浆胰岛素（n=6只小鼠/ 组）。E和F：每张胰腺切片β细胞面积的定量（n=3张切片/小鼠×3只小鼠/ 组）。G和H：血浆胰高糖素。I和J：血浆活性GLP-1。K和L：胰腺活性GLP-1（n=6只小鼠/ 组）。数据以均值±标准误或中位数（四分位数间距）表示。采用双因素方差分析进行统计学分析，A和B采用Bonferroni多重比较检验，C–F和H–L采用非配对Student t检验，G采用Mann-Whitney检验。*P<0.05，与IgG对照组相比；§P<0.05，与同组干预前相比。
我们选用不影响GCGR作用的特异性GLP-1R拮抗剂Ex9[9]，以探究GLP-1R信号通路在GCGR单抗介导的代谢效应中的作用。单独应用Ex9干预的db/db小鼠因高血糖无法控制而迅速死亡，因此该组被排除。IgG组、GCGR单抗组及GCGR单抗+Ex9组之间的体重相当（图2A）。与IgG干预相比，GCGR单抗干预4周显著降低小鼠空腹血糖并改善葡萄糖耐量，而联合Ex9干预则消除了这些作用（图2B和C）。GCGR单抗组血浆胰岛素水平高于IgG组， 而与GCGR单抗组相比，GCGR单抗+Ex9组血浆胰岛素水平降低了53%（图2D）。
图2- 全身或胰腺GLP-1R信号通路参与GCGR阻滞降低T2D和T1D小鼠血糖和促进胰岛素分泌的作用。A–D：db/db小鼠的指标。雄性db/db小鼠（8周龄）分别给予IgG（5 mg/kg/ 周，n=4）、GCGR单抗（5 mg/kg/ 周，n=5）或GCGR单抗联合Ex9（50 nmol/kg/ 天，n=4）干预4周。E–H：T1D Glp1r-/-小鼠和WT Glp1r+/+同窝对照小鼠的指标。8~12周龄的雄性和雌性Glp1r-/-小鼠和WT同窝小鼠注射STZ诱导T1D模型，每周给予IgG（5 mg/kg）或GCGR单抗（5 mg/kg）干预4 周（n=6 只小鼠/ 组）。I–L：T1D Glp1rpan-/-小鼠和Flox/cre同窝对照小鼠的指标。8~12周龄的雄性Glp1rpan-/-小鼠和Flox/cre同窝小鼠注射STZ诱导T1D模型，每周给予IgG（5 mg/kg）或GCGR单抗（5 mg/kg）干预4周（n=7 只小鼠/ 组）。A、E和I ：体重。B、F和J ：空腹血糖。腹腔葡萄糖耐量试验中血糖（C）或随机血糖（G和K）。C 和K中的箭头表示血糖仪的检测上限（33.3 mmol/L）。血浆胰岛素（D和L）或C肽（H）。数据以均值±标准误或中位数（四分位数间距）表示。采用双因素方差分析进行统计学分析，A–C采用Bonferroni 多重比较检验，E–G、I–K 采用Tukey多重比较检验；或采用单因素方差分析进行统计学分析，D采用Bonferroni多重比较检验，H采用Tukey多重比较检验；L采用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验。*P<0.05，与相同基因型小鼠的IgG对照相比；§P<0.05，与同组干预前相比；&P<0.05，与GCGR单抗干预的db/db小鼠相比；#P<0.05，与相同干预的WT或Flox/cre同窝对照小鼠相比。
Glp1r-/-小鼠和WT小鼠经STZ诱导T1D模型后，分别给予GCGR单抗或IgG干预。四组小鼠的体重相似（图2E）。与IgG对照相比，GCGR单抗显著降低WT小鼠空腹血糖和随机血糖水平，却不能降低Glp1r-/-小鼠空腹血糖和随机血糖水平（图2F和G）。GCGR单抗显著增加WT小鼠血浆C肽水平，然而，该作用在Glp1r-/-小鼠中消失（图2H）。
GLP-1R不仅在胰腺中表达，也在其他组织中表达，例如在脑部，GLP-1R信号通路参与调控摄食，进而影响葡萄糖代谢[20]。因此，我们构建了Glp1rpan-/-小鼠以探究胰腺GLP-1R的作用。STZ诱导的T1DGlp1rpan-/-小鼠和Flox/cre同窝对照小鼠给予GCGR 单抗或IgG干预。结果显示，四组小鼠的体重并无差异（图2I）。与IgG对照相比，GCGR单抗可显著降低Flox/cre小鼠空腹血糖和随机血糖水平，却不能降低Glp1rpan-/-小鼠空腹血糖和随机血糖水平（图2J和K）。GCGR单抗显著上调Flox/cre 小鼠血浆胰岛素水平，该作用在Glp1rpan-/-小鼠中消失（图2L）。
综上所述，这些结果表明，全身和胰腺特异性阻断GLP-1R削弱了GCGR阻滞的降糖作用和促进胰岛素分泌作用。
在db/db小鼠中，GCGR单抗可显著增加胰岛数量[包括小胰岛（≤10 个细胞）和大胰岛]、胰岛面积、α细胞面积及β细胞面积，联合Ex9则减弱了这些作用，且使β细胞面积减少了94%（图3A–E和补充材料图4），表明药物性阻断GLP-1R信号通路减弱了GCGR阻滞诱导的胰岛再生作用。
图3-全身或胰腺GLP-1R信号通路参与GCGR阻滞所致的T2D和T1D小鼠β细胞总量增加。A–E：db/db小鼠的指标。雄性db/db小鼠（8周龄）分别给予IgG（5 mg/kg/ 周）、GCGR单抗（5 mg/kg/ 周）或GCGR单抗联合Ex9（50 nmol/kg/ 天）干预4周。F–J：T1D Glp1r-/-小鼠和WT Glp1r+/+同窝对照小鼠的指标。8~12周龄的雄性和雌性Glp1r-/-小鼠和WT同窝小鼠注射STZ诱导T1D模型，每周给予IgG（5 mg/kg）或GCGR单抗（5 mg/kg）干预4周。K–O：T1D Glp1rpan-/-小鼠和Flox/cre同窝对照小鼠的指标。8~12周龄的雄性Glp1rpan-/-小鼠和Flox/cre 同窝小鼠注射STZ诱导T1D模型，每周给予IgG（5 mg/kg）或GCGR单抗（5 mg/kg）干预4周。A、F和K：每张胰腺切片中胰岛数量的定量。细胞数≤10个的胰岛被定义为小胰岛，其他的为大胰岛。B、G和L：每张胰腺切片中胰岛面积的定量。C、H和M：每张胰腺切片中α细胞面积的定量。D、I和N：每张胰腺切片中β细胞面积的定量（n=3~4 张切片/小鼠×3只小鼠/ 组）。E、J和O：单个胰岛胰高糖素、胰岛素及DAPI染色的代表性图片，标尺=50 μm。数据以均值±标准误或中位数（四分位数间距）表示。采用单因素方差分析进行统计学分析，A和K采用Tukey多重比较检验，D、F、G、L及M采用Dunnett T3多重比较检验，B、C、H、I及N采用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验。*P<0.05，与相同基因型小鼠的IgG对照相比；&P<0.05，与GCGR单抗干预的db/db小鼠相比；#P<0.05，与相同干预的WT或Flox/cre同窝对照小鼠相比。
同样，GCGR单抗显著增加T1D WT小鼠小胰岛和大胰岛的数量、胰岛面积、α细胞面积及β细胞面积（图3F–J和补充材料图5）。在T1D Glp1r-/-小鼠中，GCGR单抗仍可增加胰岛数量、胰岛面积和α细胞面积（图3F–H）。然而，经GCGR单抗干预后，Glp1r-/-小鼠胰岛面积小于WT小鼠（图3G）。值得注意的是，GCGR单抗不再增加T1D Glp1r-/-小鼠β细胞面积（图3I）。这些结果表明，基因敲除阻断全身GLP-1R信号通路消除了GCGR阻滞诱导β细胞再生的作用，但对α细胞增生并无显著影响。
在T1D Flox/cre小鼠和Glp1rpan-/-小鼠中，GCGR单抗显著增加小胰岛和大胰岛的数量、胰岛面积和α细胞面积（图3K–M、O 及补充材料图6）。然而，经GCGR单抗干预后，Glp1rpan-/-小鼠的小胰岛数量低于Flox/cre小鼠（图3K）。同样地，GCGR单抗不能增加T1D Glp1rpan-/-小鼠β细胞面积（图3N）。这些结果表明，基因敲除阻断胰腺特异性GLP-1R信号通路消除了GCGR阻滞诱导β细胞再生的作用，但对α细胞增生并无显著影响。结果GCGR阻滞促进T2D和T1D小鼠β细胞再生，并上调小鼠血浆和胰腺胰高糖素和GLP-1水平全身或胰腺GLP-1R信号通路参与GCGR阻滞降低T2D和T1D小鼠血糖和促进胰岛素分泌的作用全身或胰腺GLP-1R信号通路参与GCGR阻滞所致的T2D和T1D小鼠β细胞总量增加
既往谱系示踪小鼠的研究表明，GCGR单抗可通过β细胞自我复制，α细胞向β细胞转分化及β细胞新生三种途径促进糖尿病小鼠β细胞再生[14,15,32]。在此，我们检测了GLP-1R信号通路对这些再生途径的影响。在T1D WT或Flox/cre同窝对照小鼠中，与IgG对照相比，GCGR单抗显著增加BrdU+胰岛素+细胞（增殖的β细胞）和胰高糖素+胰岛素+细胞（表明从α细胞转分化而来的β细胞）的比例，以及小胰岛β细胞数量（代表β细胞新生[30]）。在T1D Glp1r-/-或Glp1rpan-/-小鼠中，GCGR单抗不再发挥这些作用（补充材料图7和8）。这些结果表明，GCGR阻滞通过β细胞自我复制、α细胞向β细胞转分化和β细胞新生途径促进β细胞再生的作用是由GLP-1R信号通路介导的。
胰高糖素已被发现是除GLP-1以外的另一种GLP-1R内源性配体[9,23,24]。由于GCGR单抗上调了循环和胰腺中胰高糖素和GLP-1的水平（图1G–L），我们试图阐明胰高糖素和GLP-1对GLP-1R激活的相对贡献。我们选用了一种特异性胰高糖素中和抗体来阻止胰高糖素与GCGR和GLP-1R结合[33,34]。与胰高糖素相比，GCGR单抗对GCGR的亲和力更强，因此，在GCGR单抗干预的情况下，GCGR已经被GCGR单抗占据，胰高糖素中和抗体只能阻止胰高糖素与GLP-1R结合[35]（图4A）。
图4-胰高糖素–GLP-1R通路激活参与GCGR阻滞诱导的T1D小鼠β细胞再生。雄性C57BL/6J小鼠（12周龄）注射STZ诱导T1D模型。糖尿病小鼠被分为4组并干预4周：1）对照组（Ctrl）（n=5），注射IgG（5 mg/kg/周，GCGR单抗对照）和A-TNP（4 mg/kg/天，胰高糖素中和抗体对照）；2）GCGR单抗组（n=5），注射GCGR单抗（5 mg/kg/周）和A-TNP；3）GCGR单抗+胰高糖素中和抗体组（n=4），注射GCGR 单抗和胰高糖素中和抗体（4 mg/kg/天）；4）胰高糖素中和抗体组（n=4），注射IgG和胰高糖素中和抗体。A：GCGR单抗和胰高糖素中和抗体的作用示意图。GCGR单抗可以与GCGR结合，并竞争性拮抗胰高糖素与GCGR的结合，而胰高糖素中和抗体可以阻止胰高糖素与GCGR和GLP-1R结合。在GCGR单抗干预的情况下，因为GCGR已经被比胰高糖素更有竞争力的GCGR单抗结合，胰高糖素中和抗体只能阻断胰高糖素与GLP-1R的结合。B：体重。C：空腹血糖。D：随机血糖。箭头表示血糖仪的检测上限（33.3 mmol/L）。E：血浆胰岛素。F：血浆活性GLP-1。G：胰腺活性GLP-1。H：每张胰腺切片中胰岛数量的定量。细胞数≤10个的胰岛被定义为小胰岛，其他为大胰岛。每张胰腺切片中胰岛面积（I）、α细胞面积（J）和β细胞面积（K）的定量。（n=4 张切片/小鼠×3只小鼠/ 组）。L：单个胰岛胰高糖素、胰岛素及DAPI染色的代表性图片，标尺=50 μm。数据以均值±标准误或中位数（四分位间距）表示。采用双因素方差分析进行统计学分析，B–D采用Bonferroni多重比较检验；或采用单因素方差分析进行统计学分析，E采用Bonferroni多重比较检验，F–I采用Dunnett T3多重比较检验；J和K采用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验。*P<0.05，与对照组Ctrl相比；§P<0.05，与同组干预前相比；#P<0.05，与GCGR单抗组相比。
在T1D C57BL/6J小鼠中，四组间体重无显著差异（图4B）。药物干预后，GCGR单抗组和GCGR单抗+胰高糖素中和抗体组的空腹血糖和随机血糖水平较基线明显下降，且低于对照组和胰高糖素中和抗体组（图4C和D）。GCGR单抗与GCGR单抗+胰高糖素中和抗体组之间的血糖水平相当（图4C和D），表明胰高糖素–GLP-1R信号通路并不影响GCGR单抗的降糖作用。
GCGR单抗组的血浆胰岛素水平高于对照组，当在GCGR单抗干预的基础上联合胰高糖素中和抗体时，该作用减弱了67%（图4E）。GCGR单抗组的血浆GLP-1和胰腺GLP-1水平均高于对照组，而GCGR单抗组与GCGR单抗+胰高糖素中和抗体组之间血浆GLP-1和胰腺GLP-1水平相当（图4F和G），因此排除了GLP-1代偿作用的可能性。
与对照组相比，GCGR单抗组的胰岛数量、胰岛面积和α 细胞面积显著增加，这些指标在GCGR单抗与GCGR单抗+胰高糖素中和抗体组之间并无差异（图4H–J、L及补充材料图9）。值得注意的是，GCGR单抗组β细胞面积大于对照组，而在联合胰高糖素中和抗体干预后，这种效应降低了35%（图4K和L）。此外，单独使用胰高糖素中和抗体有增加α细胞面积的趋势（P=0.075），但对胰岛数量、胰岛面积和β细胞面积鲜有影响（图4H–L）。这些结果表明，胰高糖素–GLP-1R信号通路至少部分参与了GCGR阻滞促进β细胞再生的作用，但不参与GCGR阻滞诱导α细胞增生的作用。
GLP-1主要由肠道L细胞合成和分泌[20]。近期，有研究表明，α细胞来源的GLP-1在血糖稳态中也发挥着重要作用，特别是在代谢应激条件下[24,36-38]。为了确定胰岛来源GLP-1在GCGR单抗调节β细胞表型中的作用，我们从正常小鼠、db/db小鼠和Glp1rpan-/-小鼠中分离了胰岛。结果显示，与IgG对照相比，GCGR单抗显著促进正常小鼠和糖尿病小鼠胰岛分泌胰岛素、胰高糖素和GLP-1（图5）。应用Ex9或Glp1r基因敲除阻断GLP-1R后，或应用胰高糖素中和抗体阻断胰高糖素–GLP-1R信号通路后，GCGR单抗的上述作用消失（图5和补充材料图10A–C）。这些结果表明，胰高糖素–GLP-1R信号通路参与了GCGR单抗在体外促进胰岛素分泌的作用。通过比较经或不经其它共处理的GCGR单抗组胰岛素的分泌水平，我们推断，在正常小鼠胰岛中，胰高糖素和GLP-1对GCGR单抗促进胰岛素分泌的作用分别贡献64%和36%（图5A）；在糖尿病小鼠的胰岛中，胰高糖素和GLP- 的相对贡献分别变为50%和50%（图5B）。这些结果表明，胰高糖素和GLP-1均激活了GLP-1R，进而参与GCGR阻滞在体外促进胰岛素分泌的作用。
图5-胰高糖素–GLP-1R信号通路参与GCGR阻滞在体外促进胰岛素分泌的作用。分离8周龄雄性正常小鼠和db/db小鼠原代胰岛，高糖（30 mmol/L）培养，经对照、Ex9（200 nmol/L）胰高糖素中和抗体（10 mg/L）共处理的情况下，分别给予1000 nmol/LGCGR单抗或IgG干预24小时。A、C和E：正常小鼠胰岛的指标。B、D和F ：db/db小鼠胰岛的指标。Ctrl：PBS 对照。A和B：上清胰岛素水平。C和D：上清胰高糖素水平。E和F：上清活性GLP-1水平（n=4）。数据以均值±标准误表示。采用单因素方差分析进行统计学分析，采用Tukey多重比较检验。*P<0.05，与经相同共处理的IgG对照组相比；#P<0.05，与经对照共处理的GCGR单抗组相比。
通过检测与胰岛素合成和加工相关基因（Ins1、Ins2、Pcsk1和Pcsk2）、葡萄糖转运蛋白（Slc2a2）、关键转录因子（Hnf4a、Nkx6-1，Neurod1和Pdx1）及成熟β细胞标志物（Mafa和Ucn3）的相对表达量评估β细胞表型。结果显示，GCGR单抗上调正常小鼠胰岛Ins1、Pcsk1、Slc2a2、Nkx6-1和Ucn3的mRNA水平，上调糖尿病小鼠胰岛Ins1、Ins2、Pcsk1、Slc2a2和Ucn3的mRNA水平（图6A和B）。通过Ex9或Glp1r基因敲除阻断GLP-1R，亦或通过胰高糖素中和抗体阻断胰高糖素–GLP-1R信号通路，均可削弱GCGR单抗的作用（图6C–F 和补充材料图10D）。这些结果表明，胰高糖素–GLP-1R信号通路介导了GCGR单抗改变小鼠原代胰岛β细胞表型的作用。
图6-胰高糖素–GLP-1R通路激活参与GCGR阻滞在体外调节β细胞表型及本研究的作用模型图。分离8周龄雄性正常小鼠和db/db小鼠原代胰岛，高糖（30 mmol/L）培养，经对照、Ex9（200 nmol/L）或胰高糖素中和抗体（10 mg/L）共处理的情况下，分别给予1000 nmol/L GCGR单抗或IgG干预24小时。A 、C和E ：正常小鼠胰岛的mRNA相对表达量。B、D和F：db/db小鼠胰岛的mRNA相对表达量（n=4）。数据以均值±标准误表示。采用非配对的Student t检验进行统计学分析。*P<0.05，与IgG对照相比。G：胰高糖素–GLP-1R信号通路参与GCGR阻滞促进β细胞再生的作用模型。在糖尿病小鼠中，α细胞来源的胰高糖素和GLP-1作用于β细胞的GCGR和GLP-1R以维持β细胞的功能。GCGR阻滞可促进α细胞来源的胰高糖素和GLP-1的生成。高浓度胰高糖素可与增加的GLP-1共同激活胰岛细胞（特别是β细胞）上的GLP-1R，进而促进β细胞再生。
在本研究中，我们发现阻滞性GCGR单抗可以通过β细胞增殖、α细胞向β细胞转分化及β细胞新生途径增加糖尿病小鼠β细胞面积，还可上调小鼠离体培养胰岛的胰岛素分泌和β细胞特异性标志物表达，提示胰高糖素可以影响β细胞的总量和表型。此外，GCGR单抗可以显著升高循环和胰腺中的胰高糖素和GLP-1水平。GLP-1R拮抗剂Ex9、全身和胰腺Glp1r敲除削弱了GCGR单抗对T2D和T1D小鼠糖代谢和β细胞面积的调控作用，以及GCGR单抗对小鼠原代胰岛β细胞表型的影响。应用胰高糖素中和抗体阻断胰高糖素与GLP-1R结合，我们发现胰高糖素–GLP-1R信号通路参与GCGR单抗诱导的T1D小鼠β细胞面积增加，同时参与GCGR阻滞调节小鼠离体培养胰岛β细胞表型。
在T1D或T2D动物和人群中，GCGR阻滞可有效控制血糖[4-8]。我们的一系列研究表明，GCGR阻滞可促进T1D和T2D小鼠β细胞再生[14-16,32]，本研究确定的GLP-1R激活是其潜在机制之一。GCGR单抗干预13周可增加食蟹猴的β细胞总量和Nkx6.1+/Pdx1+α细胞数量[17]，提示GCGR阻滞在非人类灵长类动物的β细胞再生中发挥作用。尽管GCGR阻滞对人类β细胞总量的影响仍未有研究，有报道显示，GCGR阻滞可增加T2D患者血浆胰岛素和C肽水平，并减少T1D患者的胰岛素日剂量[5,8]。在移植了人类胰岛的T1D小鼠中，经过2周洗脱，GCGR单抗仍能增加人胰岛素水平[7]，提示GCGR阻滞可能促进人类β细胞再生。重要的是，与啮齿类动物的胰岛相比，人类胰岛包含更多的α细胞（特别是分泌GLP-1的α细胞），它们与β细胞毗邻排列，而非包围β细胞，这使得人类胰岛的α细胞与β细胞之间的细胞间对话更加方便[22,39]。此外，高剂量的GCGR抗体可以上调健康个体血清胰高糖素和GLP-1水平[40]。这些结果表明，在人体中，α细胞可能在GCGR阻滞调控β细胞总量和功能中发挥更加重要的作用。
α细胞分泌的胰高糖素可能直接影响β细胞的总量和表型。多项研究表明，外源性给予胰高糖素可促进啮齿类动物和人类β细胞的胰岛素分泌[9,41]。与之类似，体内充足的胰岛素分泌需要胰岛内胰高糖素的参与[9,10,42]。然而，胰高糖素能否影响β细胞再生尚未明确。将α-TC1.9细胞（一种α细胞系）与Min6细胞（一种β细胞系）共培养可以促进β细胞增殖[43]。在斑马鱼中，注射胰高糖素或GLP-1类似物可以恢复由Gcg敲除引起的β细胞再生受损，表明Gcg基因编码的多肽是β细胞再生所必需的[44]。在本研究中，我们发现GCGR单抗治疗后，血浆和胰腺中的胰高糖素和GLP-1水平显著升高。因此，我们推测增加的胰高糖素和GLP-1参与了GCGR阻滞诱导的β细胞再生。
多项证据表明，GLP-1R激活可增强胰岛素分泌并改善血糖控制[20]。值得注意的是，GLP-1R激活可促进糖尿病小鼠和人离体培养胰岛β细胞再生[45,46]。GCGR阻滞或Gcgr敲除对血糖控制的改善依赖于功能性胰腺GLP-1R[26,47]。然而，在此过程中，GLP-1R对β细胞再生的影响尚未探究。我们近期的研究显示，与单独应用GCGR单抗相比，GCGR单抗和利拉鲁肽（一种GLP-1R激动剂）联合应用并不能进一步增加β细胞面积[48]，提示GCGR单抗本身已经充分激活胰腺GLP-1R。通过GLP-1R拮抗剂Ex9、全身和胰腺Glp1r敲除小鼠，我们的研究证实，GLP-1R信号通路参与GCGR阻滞诱导的β细胞再生。
传统观念认为，GLP-1R是由GLP-1激活的。近期，胰高糖素已被证实是GCGR和GLP-1R的双激动剂[9,23,24]。在分离的人类胰岛或啮齿类动物灌注胰腺中，阻断GCGR或GLP-1R均可损伤外源性胰高糖素刺激的胰岛素分泌，而同时阻断两个受体则可完全抑制胰岛素分泌[9,24]。尽管有些研究发现，Ex9只有减少胰高糖素刺激的胰岛素分泌的趋势[49]。类似地，在喂食条件下外源性给予胰高糖素也能显著刺激胰岛素分泌。胰高糖素不能诱导β细胞特异性Glp1r敲除小鼠分泌胰岛素，但能促进β细胞特异性Gcgr敲除小鼠分泌胰岛素，说明β细胞GLP-1R对胰高糖素刺激的胰岛素分泌是不可或缺的，而β细胞GCGR或许不是必需的[10]。与之一致的是，我们发现在GCGR单抗诱导的高胰高糖素血症状态下，血浆胰岛素水平和β细胞面积增加，而阻断胰高糖素–GLP-1R信号后，GCGR单抗促进糖尿病小鼠和离体培养小鼠胰岛分泌胰岛素的作用被削弱甚至消除。
由于GLP-1R可以被胰高糖素和GLP-1激活[9,23,24]，且GCGR阻滞均可上调两种激素[25,26]，因此很难明确哪一种激素激活了GLP-1R。两种激素同样由Gcg基因编码，因此传统的基因敲除并不适合探究此问题。GLP-1R拮抗剂Ex9可以阻断胰高糖素和GLP-1对GLP-1R的激活，因此同样不适用[9]。幸运的是，我们获得了一种特异性胰高糖素中和抗体，它可以阻止胰高糖素与GLP-1R结合，从而区分了胰高糖素–GLP-1R信号通路和GLP-1–GLP-1R信号通路。我们发现，胰高糖素–GLP-1R信号通路至少部分参与了GCGR单抗所致的促胰岛素分泌和β细胞再生作用。当然，本研究不能排除GLP-1–GLP-1R信号通路的作用，因为胰高糖素中和抗体仅仅部分逆转了GCGR单抗所致的β细胞面积增加。因此，胰高糖素和GLP-1都参与了GCGR单抗诱导的β细胞再生。据我们所知，这是第一个探讨胰高糖素–GLP-1R信号通路对β细胞再生作用的研究。
我们的研究也有一些局限性。首先，由于缺乏可应用的方法，我们没有直接研究GLP-1–GLP-1R信号通路的作用。也许使用成簇规则间隔短回文重复序列（clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）-CRISPR相关蛋白9（CRISPR associated protein 9，Cas9）系统来准确靶向编码GLP-1的外显子（而非删除全长的Gcg基因）是可行的方法[50]。
第二，在Glp1rpan-/-小鼠中，不仅β细胞的Glp1r表达被消除，其它胰腺细胞的Glp1r表达也被消除，因此，可能需要β细胞特异性Glp1r敲除小鼠来阐明GLP-1R对β细胞的直接作用。然而，GCGR阻滞或GLP-1R激活可促进多种来源的β细胞再生，包括β细胞增殖、α细胞向β细胞转分化和前体细胞来源的β细胞新生[7,14,15,17,32]。在这方面，胰腺特异性敲除（Pdx1-Cre）比β细胞特异性敲除（Ins1/Ins2-Cre）更合适，因为后者只能阻断自身来源的β细胞再生。
第三，可诱导的基因敲除小鼠更适用于成年个体的基因功能研究。尽管如此，我们使用了GLP-1R拮抗剂Ex9来药物性阻断GLP-1R，以确定GLP-1R在成年小鼠中的功能。
最后，应用超生理浓度的胰高糖素或胰高糖素类似物激活GLP-1R对于研究胰高糖素对β细胞再生作用来说可能更加直接。
综上所述，我们的研究阐明了GCGR阻滞促进β细胞再生的机制，揭示了α细胞与β细胞间对话在调节β细胞总量和表型中的作用，并为GCGR阻滞通过激活胰高糖素–GLP-1R信号促进β细胞再生提供了新的视角（图6G）。
参考文献：略
聚焦内分泌
甲状腺｜糖尿病
