满满干货 | HS/SPME-GCxGC-TOFMS 结合化学计量学方法鉴别分析新会陈皮
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2024-06-14 18:07
广东
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为快速、无损鉴别新会陈皮，利用顶空固相微萃取-全二维气相色谱-飞行时间质谱HS/SPME-GCxGC-TOFMS对新会陈皮与其他产地陈皮的挥发性成分进行分析，并结合化学计量学方法找到新会陈皮的特征化合物。 采用顶空固相微萃取对陈皮的挥发性组分进行富集浓缩，利用全二维气相色谱-飞行时间质谱对挥发性组分进行分析，获得 8 种不同产地的陈皮挥发性成分的全二维指纹谱图数据。利用 Canvas 软件获得样品挥发性成分的定性信息和相对峰面积，然后结合主成分分析PCA和正交偏最小二乘法判别分析OPLS-DA找出新会陈皮与其他产地陈皮的差异性化合物。 结果表明院单个样品检测到化合物约 500 种，通过筛选得到新会陈皮中的 102 种共有组分，用以表征新会陈皮的挥发性成分，主要是萜烯类物质和醇类化合物，这些化合物共同形成了新会陈皮独特的香气特征和药理作用， 利用主成分分析PCA和正交偏最小二乘法OPLS-DA进一步分析，达到鉴别新会陈皮与其他陈皮的目的，并得到新会陈皮与其他陈皮的 13 个潜在差异性化合物，而薄荷烯酮仅在新会陈皮中被检出，说明薄荷烯酮很有可能是新会陈皮特有的标志物 HS/SPME-GCxGC-TOFMS 结合化学计量学方法能有效鉴别新会陈皮，可为新会陈皮药材的质量评价与鉴定提供参考依据，并为其他中药质量评价提供方法。
关键词：顶空固相微萃取；全二维气相色谱飞行时间质谱；新会陈皮；主成分分析；正交偏最小二乘法判别分析。
近年发展起来的全二维气相色谱-飞行时间质谱(GC x GC-TOFMS)分析技术通过调制器将两根极性不同的柱子相连接,可实现不同沸点和不同极性组分的近正交分离,解决了传统气相色谱技术峰容量不足的问题。本研究结合 HS/SPME 与 GCxGC-TOFMS 的优点建立联用方法, 对陈皮的挥发性成分进行全组分精细分析,并采用多元统计学数据处理方法,研究新会陈皮与其他产地陈皮的差异性,以期建立一种全新的新会陈皮鉴定方法。![]()
陈皮样品均由广东省药品检验所提供,样品来自广东新会及其他地区,包括 8 个品种,共 31 个样品；C7-C40 正构烷烃标准溶液。智达InLab 全自动多功能在线前处理进样平台 -广州智达实验室科技有限公司；GGT 0620 型全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪-广州禾信仪器股份有限公司；![]()
取 5g 陈皮样品置于粉碎机中粉碎,准确称取 1.00（±0.01）g 于 20mL 顶空瓶。顶空萃取条件：样品分析萃取前老化温度为 250℃,老化时间为 15min，孵化温度为 60℃,孵化时间为 15min，振摇速度为 450r*min-1 ，萃取温度为 60℃，萃取时间为30min，解析时间为300s，解析温度为 250℃。 样品顶空萃取进行气相色谱质谱分析：气相色谱进样口温度 250℃，分流比为 20:1，一维色谱柱:DB-5ms（30mx0.25mmx0.25um)；二维色谱柱:DB-17ms (1.1mx0.18mmx0.18um)；升温程序：40℃保持 3min，以 4℃*min-1 升温到 230℃,保持 5min,载气(氦气)流速
1mL*min-1 ；调制器条件采用固态热调制器，选择 HV 调制柱(1.1mx0.25mm),调制周期为 4s；质谱检测条件:电子轰击离子源(EI 源）灯丝发射电流 200uA，电离能 70eV；离子源温度 230℃，接口温度 250℃；检测器电压1750V；采集质量范围 40~500u，采集速度 100 谱* s-1 ，溶剂延迟 2min。
采用全二维数据处理工作站软件 Canvas 对信噪比大于 10 的峰自动识别， 对每个化合物的质谱图进行谱库（NIST 17）检索，C7-C40 正构烷烃标准溶液（10mg *L-1 ）进行保留指数（retention index，RI）测定。结合质谱信息与保留指数对化合物进行定性分析，采用峰面积归一化法自动生成各成分的相对含量。利用 Simca 14.1 对挥发性组分进行主成分分析法（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）分析，找到新会陈皮与其他产地陈皮的差异性化合物。
由图 1 可知，在 19.8min 处仅能观测到 1 个色谱峰，提示只检测出 1 种成分。 然而，采样全二维气质分析可以发现在相同的保留时间处（19.8min）观测到 2 种物质（图1）。并获得 2 个不同的质谱图（图 2）。 进一步通过
NSIT 数据库匹配鉴定出 2 种成分：α,α,4-三甲基-苯甲醇和反式-p-薄荷-1(7),8-二烯-2-醇两个化合物，两者的正反匹配度均接近 900，RI 与 NIST-RI 相差±5，说明定性结果可靠。 因此，相较于传统的一维气相色谱质谱联用，全二维气相色谱飞行时间质谱联用能更好地对陈皮进行全组分的精细分析。
采用 HS/SPME-GCxGC-TOFMS 对陈皮样品进行分析，每个陈皮样品检测到约 500 个组分，按以下条件对陈皮样品的挥发性组分进行筛选：（1）在 NIST17 中的正反匹配度均大于 800；（2）峰面积相对含量超过0.001%，（3）在同种类样品中均被检出，筛选后得到每个样品组分约为 150 个 。3种新会陈皮的二维色谱轮廓图如图 3， 根据化合物的色谱图信息和定性结果可知，3 种新会陈皮的挥发性组分较为相似，将 3 种新会陈皮的化合物进行汇总分析得到 102 种共有化合物(表 2)。 由表 2 可知，3 种新会陈皮共有挥发性组分主要包括萜类化合物及其含氧衍生物39 种、醇类化合物22 种、醛类化合物12 种、酮类化合物7 种、烯烃化合物7 种和酯类化合物5 种等，这些挥发性组分共同作用形成了新会陈皮的主要香气特征，也与以往文献曾报道过的陈皮中主要挥发性成分相吻合 。新会陈皮挥发性成分中含量较大的组分为对伞花烃 （8.18%~5.64%）、 柠檬烯（5.56%~12.07%)和 α-蒎烯(5.56%~12.07%)。 在医药领域中，对伞花烃可用于制作祛痰、止咳、平咳药物； 柠檬烯具有镇咳、祛痰和抗菌等作用 ，在临床上被用来作为治疗胆囊炎的药物；而α-蒎烯也具有明显的镇咳
和祛痰作用；这些结果说明挥发性成分确实对陈皮燥湿化痰的药理效果有贡献作用。![]()
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PCA 是一种无监督的多变量统计方法，能在最大程度保留数据原始信息的基础上对样品加以区分。 将 8
种陈皮的挥发性组分进行 PCA 分析，得分如图 4。前5个主成分的方差贡献率为 79.5%。从得分图可看出，钦州陈皮和揭阳陈皮与其余陈皮区别明显，新会陈皮、乳源陈皮及桂林陈皮则分布十分接近，不能明显区分，推断与其品种相似有关。 试验进一步地采用 OPLS-DA 分析寻找新会陈皮差异性标志物。OPLS-DA 是一种有监督的多元统计方法， 能够倾向于提取利于样本分类的变量信息，这在很大程度上降低了系统噪声干扰，进而提高分类效能。将8种陈皮样品的挥发性组分进行 OPLS-DA 分析，将 3 种
新会陈皮归类为 “新会INHUI”， 余下 5 种陈皮归类为 “其他 OTHERS”。 由图 5A 可知，新会陈皮与其他陈皮得到明显区分。 该模型下 R2Y(cum)和 Q2(cum)分别为
0.995 和 0.991， 验证模型时 R2 和 Q2 的截距分别为
0.12 和 0.52（图 5B），说明模型稳健可靠。可利用 OPLS-DA 中的 S-plot 图以及 VIP 值进行差异化合物的识别。 由图 5C 可知，S 型曲线上的每一个点代表 1 个化合物， 纵坐标表示关联性，横坐标表示方差，选取|p(corr)|>0.5
和|p|>0.1 且 VIP 值大于 2 作为筛选条件， 得到 13 种潜在差异化合物，这些差异化合物在陈皮样品中的相对含量见表3。 结果显示，薄荷烯酮仅在“新会 XINHUI”陈皮中被检出。 因此，薄荷烯酮很有可能是区分新会陈皮标志物，这为新会陈皮的鉴别提供新的科学依据。![]()
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本研究采用 HS/SPME-GCxGC-TOFMS 对 5 个产地共 8 种陈皮的挥发性组分进行分析鉴别，其中单个样品检测到化合物约 500 种，体现出全二维气质联用强大的分离和检测能力。 通过一定条件筛选得到新会陈皮中的
102 种共有组分，主要包括萜类化合物及其含氧衍生物39 种、醇类化合物22 种、醛类化合物12 种、酮类化合物7 种、烯烃化合物7 种和酯类化合物5 种等，这些化合物共同形成了新会陈皮独特的香气特征和
药理作用。利用主成分分析PCA和正交偏最小二乘法OPLS-DA进一步分析，通过 OPLS-DA 模型，达到鉴别新会陈皮与其他陈皮的目的，并得到新会陈皮与其他陈皮的 13 个潜在差异性化合物，而薄荷烯酮仅在新会陈皮中被检出，说明薄荷烯酮很有可能是新会陈皮特有的标志物，但这一结论仍需继续深入研究并进一步验证。试验结果表明，HS/SPME-GCxGC-TOFMS 结合化学计量学方法对新会陈皮进行鉴别是可行的， 这可为深入研究陈皮的化学性质提供更全面的科学依据，对识别陈皮品种、鉴别新会陈皮具有一定的参考价值。
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