【中国声音】mSystems︱南方医科大学珠江医院孙海涛团队利用多组学揭示肿瘤内细菌与胶质瘤之间的相互作用

脑胶质瘤是最常见的原发性恶性脑肿瘤，其中多形性胶质母细胞瘤（glioblastomas，GBM）恶性程度最高，具有高度异质性与浸润性。尽管GBM目前采用包括外科手术、放疗、系统治疗（化疗、靶向治疗）的多模态综合治疗方法，但患者总体生存期短，预后较差。现有研究进展表明复杂的遗传学背景、免疫状态、环境等因素在GBM的发生和进展中扮演了重要角色，具体机制迫切需要进一步的阐明。

人类微生物包括细菌、真菌和病毒，在一些生理和病理过程中发挥着关键作用。随着微生物组表征工具的进步，一些研究发现，肿瘤内微生物成分存在于多种肿瘤组织中，与肿瘤的发生、发展和治疗疗效密切相关。然而，在胶质瘤中是否存在微生物以及它们发挥了怎样的功能尚不明确。

南方医科大学珠江医院孙海涛教授团队近年来聚焦重大脑疾病（脑血管病、脑肿瘤等）与微生物菌群关系开展一系列研究。基于临床生物样本，利用多组学和组织透明技术等前沿研究手段，围绕胶质瘤瘤内是否存在微生物菌群以及其在胶质瘤中是否发挥作用开展相关探索性研究。2022年，该研究团队利用组织透明技术联合三维成像方法，提出了一种三维（3D）原位瘤内微生物群可视化和定量方案，并呈现了细菌成分的特征和分布情况，为人胶质瘤中存在微生物群菌群提供了初步证据。

• 拓展阅读1：Zhao J, He D, Lai HM, Xu Y, Luo Y, Li T, Liang J, Yang X, Guo L, Ke Y, Zhou H, Wu W, Guo H, Sun H. Comprehensive histological imaging of native microbiota in human glioma. J Biophotonics. 2022 Apr;15(4):e202100351.
• 拓展阅读2：Liang J, Li T, Zhao J, Wang C, Sun H. Current understanding of the human microbiome in glioma. Front Oncol. 2022 Aug 8;12:781741.

2024年12月11日，该团队在mSystems期刊上发表了题为“Multi-omics analysis reveals the interplay between intratumoral bacteria and glioma”的原创性研究。李婷、赵展毅为该文的共同第一作者，孙海涛为该文的通讯作者。该研究分别比较了胶质瘤患者的肿瘤组织和癌旁组织的微生物组学、转录组学和代谢组学特征，呈现了胶质瘤患者组织中微生物组成变化和微生物相关的RNA和代谢物的变化图谱。此外，该团队通过体内外模型进一步验证了在胶质瘤组织中富集的具核梭杆菌对胶质瘤增殖的影响。本研究为胶质瘤的致病机制理解和干预提供新的视角。

该研究纳入了50例胶质瘤患者，收集了50个胶质瘤组织和15个匹配的癌旁组织进行16S rRNA基因测序；其中20个胶质瘤和6个匹配的癌旁组织进行非靶向代谢组学分析；16个胶质瘤和3个匹配的癌旁组织被用于转录组学测序；同时来自这些患者的组织切片被用于细菌成像。（图1）

图1. 胶质瘤瘤内微生物发现的研究设计图

首先，16S rRNA基因测序发现胶质瘤组织相较于癌旁组织，微生物组成发生了明显变化，其中胶质瘤组织中的厚壁菌门和梭杆菌门丰度水平显著高于癌旁组织。另外，Lefse分析发现Fusobacterium、Longibaculum、Intestinimonas、Pasteurella、Limosilactobacillus和Arthrobacter等6个属明显富集于胶质瘤组织中。为了表征肿瘤内细菌的功能改变，该研究团队使用PICRUSt，基于KEGG数据库，预测了胶质瘤和癌旁组织之间的功能同源性，发现富集在包括神经活性配体受体的相互作用等10个通路。（图2）

为了进一步验证胶质瘤组织中细菌的存在，研究团队采用连续切片对细菌脂磷壁酸（LTA）和脂多糖（LPS）进行免疫组化染色，并对16S rRNA进行FISH染色。他们发现在组织的同一位置观察到细菌LPS和RNA信号的存在，而LTA信号没有被检测到。多色免疫荧光染色，发现GFAP+ LPS+细胞的丰度显著高于CD68+ LPS+细胞，这表明细菌LPS在肿瘤细胞中比在巨噬细胞中更为普遍。（图3）

为了进一步了解肿瘤内微生物群和宿主差异基因表达之间的潜在相互作用，研究团队对同一组样本进行了转录组测序，并使用Spearman相关分析评估了它们之间的关联。研究结果发现有52个差异表达的基因与alpha多样性具有显著的相关性，其中28个差异表达的基因与差异细菌表现出负相关，而这28个差异表达的基因属于胶质瘤中下调的基因，KEGG通路富集分析显示它们在cholinergic synapse、serotonergic synapse、glutamatergic synapse和dopaminergic synapse等通路中富集。（图4）

随后，为了进一步阐明胶质瘤与瘤内微生物群相关的代谢物，研究团队对两组间的差异代谢物和alpha多样性进行了相关性分析，鉴定出了16种与alpha多样性相关的代谢物，而这16种差异代谢物与6种差异细菌也存在相关性。(R)-N-methylsalsolinol与Longibaculum、Limosilactobacillus、Intestinimonas的丰度呈正相关，而N-acetylglutamic acid、N-acetyl-L-aspartic acid、N-acetylaspartylglutamic acid和D-alanine与Arthrobacter呈负相关。（图5）

图5. 差异细菌与代谢物之间的Spearman相关分析的热图

为了进一步探讨人胶质瘤组织中微生物组与转录组、代谢组之间的相关性，该研究团队利用网络分析发现在胶质瘤内微生物群、组织代谢物和宿主基因之间形成了相互关联的网络，中介分析发现HTR1D和STAT4与大多数特征细菌和差异代谢物有关。N-acetylglutamic-acid、PC（22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)）和(R)-N-methylsalsolinol也显示出和一些特征细菌和差异表达基因的相关性。进一步中介分析发现Arthrobacter通过N-acetylglutamic acid促进RFK的表达（P_mediation=0.02），Longibaculum通过PC（22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)）促进GRIN2B的表达（P_mediation=0.016），此外，Limosilactobacillus通过(R)-N-methylsalsolinol促进RIMKLA的表达（P_mediation=0.042）。这些代谢物和基因均与神经元活性相关，因此整合分析的结果表明，神经胶质瘤的瘤内微生物群可能通过一些与神经元功能相关的代谢物来影响神经元相关基因的表达。（图6）

接着，研究团队用胶质瘤小鼠模型探究了在微生物组分析中发现的特征性菌属-具核梭杆菌，对胶质瘤增殖的影响。研究结果发现，Fn会促进肿瘤生长，且这种促进作用会被甲硝唑抑制。对小鼠肿瘤的转录组学发现了70个差异基因，它们富集于IL-17信号通路和TNF信号通路。其中，Fn处理后的小鼠肿瘤中的CCL2、CXCL1、CXCL2的表达水平明显高于其他组。ELISA检测也验证了这个结果。代谢组学发现N-glycolylneuraminic acid在Fn处理后的小鼠肿瘤中的表达水平明显高于其他组。因此，整合分析的结果表明Fn可能是通过促进CCL2、CXCL1和CXCL2的表达和N-glycolylneuraminic acid的水平促进胶质瘤的生长。（图7）

为了更好地模拟临床真实世界，研究团队建立了患者来源的胶质瘤类器官模型，以进一步验证Fn对胶质瘤增殖的促进作用。研究结果表明与Fn共培养的胶质瘤类器官的增殖活性更高。ELISA结果显示，Fn共培养的胶质瘤类器官的上清中，CCL2、CXCL1和CXCL2的水平相较于对照组明显增高，这再次证明，Fn促进胶质瘤增殖并上调CXCL2水平。（图8）

孙海涛 主任医师

南方医科大学珠江医院

• 南方医科大学珠江医院临床生物样本资源中心主任、检验医学部副主任

• 外科学（神外）博士，主任医师、副研究员，硕导，神经外科中心研究生导师，广东省医学检验临床医学研究中心PI

• 主要研究方向：脑重大疾病（脑血管病、脑肿瘤等）基础与临床转化研究；临床生物样本库的标准化建设与转化应用。作为项目负责人承担包括国家自然科学基金、广东省自然科学基金、香港HMRF等9项科研课题。以一作/通讯作者发表SCI收录文章30余篇，包括Cell research、Gut、Brain Behavior and Immunity、CNS Neuroscience & Therapeutics、Aging and Disease等。曾获选“香江学者计划”、“广州市珠江科技新星”等人才项目及荣誉称号、中组部第24批赴赣博士服务团成员。担任Aging & Disease和Interdisciplinary Medicine青年编委

• 中国神经科学学会神经损伤与修复分会委员、中国医药生物技术协会组织生物样本库分会委员、中国研究型医院学会检验专业委员会委员&细胞外囊泡研究与应用专业委员会委员、广东省人类遗传资源保藏应用学会副会长兼副理事长、广东省精准医学应用学会神经肿瘤分会常委等

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