γ-聚谷氨酸（γ-PGA）是一种具有水溶性、生物相容性、可降解、可食用的高分子聚合物，对人和环境无毒，广泛应用于农业、化妆品、食品和医药等领域。在枯草芽孢杆菌中，degQ基因通过向下游传递细胞密度信号，对γ-PGA生物合成至关重要。日本国家农业与粮食研究所Keitarou Kimura研究团队在Journal of Bioscience and Bioengineering上发表题为Poly-γ-glutamic acid production of Bacillus subtilis (natto) in the absence of DegQ：A gain-of-function mutation in yabJ gene的文章，通过全基因组测序鉴定了三株degQ基因敲除后仍能产生γ-PGA的突变体，都在YjgF/YER057c/UK114蛋白家族yabJ基因上出现第103位丝氨酸变为苯丙氨酸(S103F)，YabJ蛋白参与抑制嘌呤合成基因purA，突变后获得了刺激degU表达的功能，这一功能参与了γ-PGA合成调控，与产量恢复有关。![]()
先前研究中发现的三株在无DegQ下产生γ-PGA的突变体△degQ sup4、△degQ sup6和△degQ sup8，表现出非常相似的表型，包括恢复了遗传能力，γ-PGA和外显酶的生产，以及菌落形态。全基因组测序发现在yabJ基因上都有一个共同突变，第103位丝氨酸变为苯丙氨酸S103F。在亲本株aprE位点引入野生和突变型yabJ，构建△degQ PyabJ-yabJ和△degQ PyabJ-yabJ S103F。发现只有引入yabJ S103F后，才产生γ-PGA。构建yabJ被破坏且yabJ S103F可诱导的菌株△degQ△yabJ Pspac-yabJ S103F，该株在加入1mm的IPTG后产生PGA。而野生型yabJ对照菌株加入IPTG也不产生PGA。检测合成操纵子pgsBCA表达情况。亲本中未检测到PgsB-LacZ活性，表达yabJ S103F时，PgsB-LacZ活性恢复。此外，yabJ S103F和△yabJ突变株在LB和GSP中均能正常生长。![]()
图1 野生型和各突变株PGA表达量
通过yabJ S103F的突变，degQ被干扰后的γ-PGA产量得以恢复，但仍然需要degU。也就是说，yabJ S103F显性等位基因能够绕过degQ的功能，但不能绕过degU。通过监测DegU-Lacz表达来反应DegU的水平。在携带yabJ S103F的细胞中，degU-lacz的表达量高于野生型和亲本株。携带诱导启动子的菌株△degQ△yabJ Pspac-yabJ S103F只有在培养基中添加IPTG时才显示出degU-lacZ的高表达，破坏degQ和yabJ并未显著影响其表达水平。![]()
图2 degU-lacZ融合基因在突变体中表达
进一步通过Western blot检测DegU蛋白在细胞中的表达。pgsBCA的DNA结合转录调控因子DegU在野生株中明显表达，而在△degQ株中表达水平较低。在△degQ菌株中引入yabJ S103F后，DegU的表达量能达到与野生型相当的水平。同时阴性对照△degU菌株无条带。这表明所使用的抗血清至少在所使用的条件下对DegU具有特异性。此外，菌株△degQ△yabJ aprE::Pspac-yabJ S103F的DegU基因表达只有在加入IPTG后才出现上调。![]()
图3 Western blot分析DegU蛋白
Ser103附近的氨基酸序列在YjgF/YER057c/UK114家族中高度保守，包括推测的脱氨基催化残基Arg102。Ser103和Arg102残基位于同型三聚体YabJ亚单位间的空腔中，携带羧酸基团的代谢物为假定底物进入这个腔。因此，突变发生在一个重要的结构点，该点对底物和其他化合物是开放并可接近的。![]()
图4 细菌和酵母中YjgF/YER057c/UK114家族蛋白氨基酸序列比对
DegU的细胞数量在degQ破坏后大大减少，yabJ S103F突变后在转录水平增强了DegU产生。DegU是一个正自调节基因，转录上调可能比lacz融合实验高得多。DegU-Lacz的表达水平不受degQ干扰的影响。因此，yabJ S103F对degU的转录增强被认为克服了△degQ细胞中degU的不稳定性。△yabJ菌株的PgsB-LacZ水平与野生型相当，但实际产生的γ-PGA量少于野生型。枯草芽孢杆菌细胞表现出群集运动，活跃的群集细胞在琼脂平板上迅速传播。群集运动和γ-PGA的产生相关，一些群集阴性突变体也是γ-PGA阴性。而△yabJ菌株表现出群集运动缺陷，这种缺陷可能会对γ-PGA产量产生不利影响，还有待进一步的实验阐明。![]()
图5 △yabJ突变细胞的群集运动
本研究通过筛选抑制细胞密度信号转导缺陷的枯草芽孢杆菌γ-PGA阴性表型突变体，确定了yabJ基因的一个功能获得性突变S103F。在携带该突变的细胞中，直接调控γ-PGA合成操纵子的degU基因表达水平显著升高。yabJ S103F导致DegU水平上调是γ-PGA恢复的主要原因。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1016/j.jbiosc.2019.05.014
枯草芽孢杆菌是食品、饲料安全菌种，具有易培养、高效表达（或分泌表达）蛋白等优势。淳瑶生物研发的MATE枯草表达系统，拥有多种“表达质粒-宿主菌种”搭配方案，针对不同类型目的蛋白进行胞内、胞外特异性优化，实现目的蛋白“高表达”（占总蛋白60%以上表达量，分泌胞外蛋白量超过80%），“高严谨”（可达790倍诱导倍数），和“耐葡萄糖”（20g/L葡萄糖条件下表达强度不变），并具有自主知识产权和发明专利群，可以广泛应用食品、饲料、医药等领域。
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