细菌群体感应(QS)是基于信号分子(SM)浓度随细胞密度增加，超过临界值后，多种适应性基因表达急剧上升到最高水平。这种急剧的转变通常需要依赖SM的正反馈回路。而枯草芽孢杆菌中ComQXPA通讯系统没有这种回路，基因表达的急剧转变是如何实现的呢？斯洛文尼亚卢布尔雅那大学Ines Mandic-Mulec研究团队在Communications Biology上发表题为Peptide signaling without feedback in signal production operates as a true quorum sensing communication system in Bacillus subtilis的文章，通过实验和数学建模，观察到SM肽ComX编码了细胞密度、特定细胞生长速率和氧浓度等信息，从而使SM产量呈幂指数增长，产生协同反应使基因表达水平的急剧转变。这种超敏感性使ComQXPA可以在SM浓度比其他QS系统低100-1000倍的情况下运行，大大降低了昂贵肽信号的总代谢成本。![]()
细菌分泌并共享群体感应信号分子(SM)，SM与特定受体结合，达到临界浓度后诱导细胞密度依赖性反应，产生微生物群体相互作用。大多数QS系统将信号产生和检测的耦合与信号放大自身相结合，当信号放大被人为打破时也可以达到最大响应水平。而枯草芽孢杆菌ComQXPA通信系统中，信号分子的产生与检测不耦合。ComQXPA通信系统涉及ComQ异戊烯基转移酶，ComX（即SM）先合成为55个残基前肽，然后被ComQ该酶修饰为异戊烯化5~10氨基酸肽形式的成熟的ComX，分泌后与膜受体组氨酸激酶ComP结合，触发向ComA的磷酸化转移。磷酸化的ComA直接调节各种基因的表达，其中srfA操纵子可作为信号分子SM反应的指标。![]()
图1 信号分子浓度依赖性响应模式
首先定量受体缺陷菌株PS-216（ΔcomP）在旧培养基中ComX的浓度变化，发现浓度与种群密度正相关，进入静止期后保持在10nM不变，但ComX浓度是随着细菌密度的平方增加，而单个细胞ComX量是线性增加，这表明ComQXPA有一个超敏感的编码器模块，使每个细胞SM产生依赖于细胞密度和特定生长率。革兰阳性菌肽信号在代谢上成本高，估算枯草芽孢杆菌中单分子ComX需要484个ATP，大大超过阴性菌，但静止期信号浓度比阴性菌低100-1000倍。因此肽信号的高成本被低浓度所缓冲。比较PS-216（ΔcomP）和PS-216（ΔcomQXP）菌株的生长曲线，最大值及斜率几乎相同，这表明ComX的产生没有显著的代谢负担，肽信号成本可以忽略不计。![]()
图2 枯草芽孢杆菌信号分子的积累和生产成本
ComQXPA通信系统中，单个细胞SM产量不由正反馈回路控制，而是由细胞密度和特定生长率控制。那细菌如何感知的呢？枯草芽孢杆菌中氧含量是关键因素之一。限制供氧后，监测培养菌群的氧浓度变化，发现生长曲线与溶解氧几乎完全负相关。溶解氧下降最明显是在指数期，也是种群增长率最大时。用ComX生物传感器BD2876(ΔcomQ，srfA-lacZ)检测培养基有显著响应，表明ComX正在产生。如果在培养时持续供氧，维持固定氧饱和度，此时细菌密度和溶解氧间的负相关关系被打破，高氧饱和度消除了ComX的产生，生物传感器响应极低。这一结果表明，当没有“天然”氧梯度时，ComQXPA通信系统失去了功能。因此，氧含量可以作为细胞密度和生长速率的指标。![]()
图3 氧对信号分子ComX的影响
接着研究细胞反应RM如何依赖于SM，将信号缺陷的PS-216(ΔcomQ，PsrfAA-yfp)菌株在不同浓度的ComX下孵育4h，测量Yfp荧光，得到对ComX反应的相对度量。结果表明，反应强度呈S型曲线。拟合数据发现，反应灵敏度在ComX的3~5nM处最大，10nM达到响应最高值，相应下限值为0.2~0.5nM。进一步将菌株接种到新鲜培养基后，细胞分裂使胞内β-半乳糖苷酶稀释，酶活性在孵育2h后急剧下降。同时，培养基中ComX浓度在生长中呈指数增长，很快达到激活srfA的临界浓度，酶活性止跌回升，此时细胞仍处于指数期。反应曲线陡峭的斜率表明酶合成速率超过了细胞分裂造成的稀释。每个细胞响应与菌体密度近似线性相关，表明与细胞生长的强耦合。![]()
图4 细胞对ComX的非线性响应
接着考察细胞水平上依赖ComQXPA的信号反应。构建双荧光标记菌株PS-216(comQ-yfp，srfA-cfp)，观察不同生长阶段的荧光。结果表明，信号基因comQ-yfp的表达模式遵循对数正态分布，存在亮10倍的高产细胞仅占0.1~1%。表明ComX由大多数细胞产生。srfA-cfp高产细胞占比不超过0.1%，对总体贡献更低。comQ-yfp转移到新培养基后立即观察到异质性表达，但无高产细胞。而后分布向低荧光强度偏移，在3~4h单细胞荧光增加，表达率高于分裂率。在激活反应中也观察到类似模式。细胞群中除极少量高产细胞，都遵循单峰对数正态分布的表达模式。这表明枯草芽孢杆菌的ComQXPA通信现象不局限于个体，可以在群体水平进行研究，平均值能很好代表群体。![]()
图5 双标记菌株的荧光定量研究
完美的QS系统在细菌密度达到阈值时产生反应，然后立即切换到完全反应。将前述实验数据进行处理，得到ComQXPA对细菌密度的标准化响应曲线，类似于分级开关式诱导。但这样的完美开关要求所有细胞完全同步，并立即切换到最大反应，没有时间适应信号刺激。对真正的群体感应系统，大部分的反应必须发生在同一代的分裂细胞中。ComQXPA系统中同一代分裂细胞实现了50%响应。另一方面，如果系统在信号产生模块和响应模块间缺乏灵敏度，50%响应在同一代细胞中会发生大量偏移，延长了所需的细胞密度和时间。![]()
图6 信号分子对细菌密度和协同响应的二次依赖性
本研究表明枯草芽孢杆菌ComQXPA通信系统作为一个真正的QS系统，采用了类似开关的动力学，通过连接超灵敏的信号产生和响应模块来实现。信号分子的非线性增加与生长速率和溶解氧浓度相耦合。信号的产生和反应分布于整个菌群中且异质性有限。这种超敏感性系统可以在极低信号浓度下工作，降低了总代谢成本。相关论文信息：
https://doi.org/10.1038/s42003-020-01553-5
枯草芽孢杆菌是食品、饲料安全菌种，具有易培养、高效表达（或分泌表达）蛋白等优势。淳瑶生物研发的MATE枯草表达系统，拥有多种“表达质粒-宿主菌种”搭配方案，针对不同类型目的蛋白进行胞内、胞外特异性优化，实现目的蛋白“高表达”（占总蛋白60%以上表达量，分泌胞外蛋白量超过80%），“高严谨”（可达790倍诱导倍数），和“耐葡萄糖”（20g/L葡萄糖条件下表达强度不变），并具有自主知识产权和发明专利群，可以广泛应用食品、饲料、医药等领域。
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