利用枯草芽孢杆菌从豆渣水解物中生产乙偶姻及衍生物川芎嗪
文摘
科学
2024-07-16 15:00
天津
豆渣是一种可再生资源，储量丰富，成本低廉，是生物生产高附加值化学品的发酵原料。乙偶姻是四碳平台化合物，常用于合成药物、香精和多功能材料。以豆渣为原料，利用枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻，蕴含着巨大的商业潜力。近日，南京工业大学郝宁教授团队在AMB Express上发表题为Production ofacetoin and its derivative tetramethylpyrazine from okara hydrolysate with Bacillus subtilis的文章，通过优化豆渣酶解工艺，同时构建有效利用阿拉伯糖和半乳糖的重组枯草芽孢杆菌BS03，乙偶姻产量为11.79g/L。在7.5L反应器中，以豆渣酶水解产物为原料，经分批发酵和补料分批发酵分别获得11.11g/L和29.7g/L乙偶姻，可进一步转化为5.33g/L和13.37g/L川芎嗪，为利用可再生资源商业化生产乙偶姻提供了参考。
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首先对酶解过程进行优化。豆渣的主要成分为纤维素、半纤维素和木质素等，通常用高温酸水解和酶解两种方法来处理。当豆渣浓度为120g/L，纤维素酶负荷量为20FPU/mL时，水解液中总糖浓度最高，约30.58g/L，进一步添加纤维素酶不能再提高总糖量。添加β-葡萄糖苷酶使纤维素二糖进一步水解，酶负荷量为3FBG/mL时，葡萄糖浓度提高4.79%。同时，低浓度的阿拉伯糖和半乳糖也增加了半纤维素水解。木聚糖酶浓度基本不影响总糖和氨基酸水解。果胶会影响单糖的释放，加入不同浓度的果胶酶，负荷量达到383 PGNU/mL时可出现单糖溶解现象。![]()
图1 不同酶溶解豆渣中单糖和氨基酸
扫描电镜显示，加入果胶酶后，豆渣的表面结构由紧密有序变为疏松。将加入120g/L豆渣产生的还原糖用于后续的发酵实验。在此底物浓度下，获得约43g/L的总糖，包含约32.78g/L的葡萄糖，1.43g/L阿拉伯糖，7.74g/L半乳糖和12.21g/L的总氨基酸。![]()
图2 不同方法处理干豆渣的SEM图像
接着构建工程菌株在葡萄糖-半乳糖混合物中产生乙偶姻。敲除168菌株中乙偶姻分解代谢关键基因bdhA和acoA，得到菌株BS01，再利用pMA5质粒HpaII启动子过表达阿拉伯糖转运蛋白基因araE，构建菌株BS02。在此基础上同时过表达Leloir途径基因galKTE，以增加阿拉伯糖的利用，形成菌株BS03。![]()
图3 葡萄糖和半乳糖混合物中产生川芎嗪
在含10g/L葡萄糖和5g/L半乳糖的M9培养基中发酵，BS01-pMA5、BS02和BS03在36h内完全消耗了葡萄糖。BS01-pMA5和BS02不消耗半乳糖。BS03在12~24h以0.13 g/L/h消耗1.59g/L半乳糖后，生物量急剧下降。剩余的半乳糖没有被消耗。敲除枯草芽孢杆菌PTS-Glc系统中的关键酶ptsG、yyzE和ypqE，提高半乳糖利用并减弱CCR效应，得到BS04菌株。葡萄糖消耗下降0.414~0.268g/L/h，半乳糖消耗增加了0.13~0.21g/L/h，但乙偶姻产量也下降了10.4%，产率由0.0847g/L/h降至0.0759g/L/h。![]()
图4 BS01~04在M9中发酵生产乙偶姻
豆渣酸水解后的单糖包括葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。在BS03中测定不同单糖作碳源的产量。用葡萄糖时，乙偶姻在12~48h浓度增加2.84倍，最高为4.26g/L，产率0.089g/L/h，阿拉伯糖为碳源时乙偶姻在12~48h浓度增加3.5倍，最高为2.8g/L，产率0.058g/L/h，二者中乳酸浓度从3.54和2.83g/L逐渐降到0。而半乳糖和木糖作碳源时乙偶姻仅产生0.07和0.48g/L，并产生浓度分别为2.16和2.68g/L的乙酸。葡萄糖为碳源时乙酸会逐渐被消耗。![]()
图5 BS03以不同单糖为碳源生产乙偶姻
与豆渣酸水解产物相比，酶水解产物中葡萄糖的比例更高，更适合乙偶姻的生物转化。当初始糖浓度为29g/L时，BS03在微需氧条件下可产生11.05g/L的乙偶姻，转化率为46.08%。玉米干粉是枯草芽孢杆菌发酵乙偶姻的最佳营养来源，以豆渣为碳源可降低其用量。不添加玉米干粉时，BS03的乙偶姻产量约为11.79g/L，添加后产量都略有增加。用3g/L尿素模拟豆渣水解物，同时添加2.5、7.5、15g/L的玉米干粉和同浓度酵母浸提液，结果表明，7.5g/L玉米干粉的乙偶姻产量和产率最高。![]()
图6 豆渣酶水解物结合玉米粉生产乙偶姻
最后使用豆渣水解产物在7.5L反应器中进行中试。葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的初始浓度分别为22.35、5.31和1.36g/L。BS03对葡萄糖-半乳糖进行了连续利用。在33h时乙偶姻产量最高，为11.11g/L，可转化为5.33g/L川芎嗪。此时葡萄糖和阿拉伯糖消耗完毕，半乳糖消耗率0.12g/L/h。36h时，半乳糖用量约2.105g/L，乙偶姻产量下降6.67%。为了获得更高产量，进行分批补料发酵，69h内从90.56g/L葡萄糖中获得约29.7g/L的乙偶姻，可转化为13.37g/L川芎嗪。此时半乳糖剩余18.48g/L，阿拉伯糖剩余0.905g/L，发酵117h后，半乳糖和阿拉伯糖被完全消耗，乙偶姻产量下降了10.3%。![]()
图7 BS03在豆渣水解物中发酵生产乙偶姻
本研究开发了豆渣酶解工艺，用纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶水解豆渣，得到含混合糖的水解物。再以枯草芽孢杆菌168为底盘，敲除分解代谢基因bdhA和acoA，过表达阿拉伯糖转运蛋白基因araE和Leloir途径基因galKTE。在不以玉米干粉为氮源时，重组菌BS03能合成11.79g/L乙偶姻。最后，通过补料分批发酵分别获得高达29.7g/L乙偶姻，可转化为13.37g/L川芎嗪，为枯草芽孢杆菌利用可再生资源生产乙偶姻提供了参考。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1186/s13568-023-01532-z
枯草芽孢杆菌是食品、饲料安全菌种，具有易培养、高效表达（或分泌表达）蛋白等优势。淳瑶生物研发的MATE枯草表达系统，拥有多种“表达质粒-宿主菌种”搭配方案，针对不同类型目的蛋白进行胞内、胞外特异性优化，实现目的蛋白“高表达”（占总蛋白60%以上表达量，分泌胞外蛋白量超过80%），“高严谨”（可达790倍诱导倍数），和“耐葡萄糖”（20g/L葡萄糖条件下表达强度不变），并具有自主知识产权和发明专利群，可以广泛应用食品、饲料、医药等领域。
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