甲基萘醌-7（MK-7）是一种脂溶性维生素K2，在人体凝血级联、维持骨代谢、预防动脉硬化、调节炎症和神经保护方面发挥着重要作用。生物合成的常用GRAS安全的枯草芽孢杆菌，生长速度快，分泌能力强，具有良好的遗传稳定性和丰富的基因修饰工具。中科院合肥物质科学研究院王鹏和郑之明研究团队在Microbial Cell Factories上发表题为Bottom-up synthetic biology approach for improving the efficiency of menaquinone-7 synthesis in Bacillus subtilis的文章，采用自下而上的合成生物学方法对MK-7通路中限制性酶DXS、Fni、DXR、MenF、AroA和MenA依次过表达，引入NADH激酶辅因子再生体系降低副产物，最终构建了一个高效低碳、辅因子循环的MK-7合成菌株，发酵后滴度达到53.07mg/L，是168菌株的4.52倍。本策略普遍适用于萜类化合物合成平台，为高价值规模化生产奠定了基础。![]()
枯草芽孢杆菌MK-7生物合成途径可以被划分为7个模块，即糖醇摄取途径、MK-7途径、莽草酸SA途径、甲基赤藓糖醇MEP途径、磷酸戊糖PPP途径、糖酵解EMP途径和三羧酸循环，有37种酶和多种辅助因子参与。其中七戊烯基转移酶MenA是一种膜蛋白，具有细胞毒性，用基因工程难以过表达。MEP和SA途径中磷酸异构酶DXR、二磷酸还原酶IspH和羧乙烯基转移酶AroE都需要NADPH作辅因子。胞内NADPH水平是影响合成的另一个关键因素。
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图1 枯草芽孢杆菌MK-7的合成途径
首先，增强MEP、SA和MK-7途径的代谢通量。在萜类合成中，DXS、Fni和DXR三种酶催化的裂解反应及menFDHBEC基因簇将分支酸转化为DHNA是主要限速步骤。用P43启动子依次过表达dxs和fni，得到菌株BS001和BS002。用P43代替dxr和menF的原生启动子，得到BS004。再用Phbs过表达aroA，得到BS005。摇瓶发酵后，MK-7滴度总体上升。但重组菌密度普遍下降，过表达dxs和fni的菌株更为明显，可能与有毒中间体IPP积累有关。过表达dxr和menF后，IPP消耗加快，生长性能有所回复。MK-7在BS005中的最终产量为32.93mg/L，是野生型的2.8倍。通过增加前体供应有效提高了MK-7产量。![]()
图2 增加前体供应，推动碳进入MK-7合成
接着，支持MK-7通路并减少分支酸消耗。将中等强度启动子Psigw与menA融合，整合到BS005的dhbB位点，得到BS007。将P43和添加了Mistic标签的P43分别与menA融合，得到BS008和BS009。用敲除dhbB基因的BS006做阴性对照。结果显示，重组菌株BS006~009中MK-7的滴度分别为28.15、30.07、39.01和34.33mg/L。BS006滴度低于BS005，可能与敲除dhbB后生长不良有关，BS007~009的生长情况明显改善。qRT-PCR显示，在3种优化表达策略中，单独使用P43时menA的表达量最高，融合Mistic标签的P43其次，Psigw起的作用最小，同时menA表达量与MK-7的滴度正相关。![]()
图3 优化关键酶MenA的表达
随后，利用合成化学计算提高物质代谢和能量代谢的适应性。枯草芽孢杆菌合成1mol DMK-7需要19mol甘油和10mol NADPH，同时产生11mol NADH。MK-7产量越高，胞内NADH积累水平越高。当还原能力不足时，合成就会受到抑制。为了重新平衡系统，细胞会合成消耗NADH的副产品，这降低了底物经济性。枯草芽孢杆菌没有天然的NADH磷酸化酶，使用Rhea数据库寻找NADH-NADPH的化反应途径，发现酿酒酵母线粒体Pos5P是一种表征良好的NADH激酶，对NADH的亲和力比NAD+高50倍以上。因此，将pos5P整合到BS008的基因组代谢网络模型中，以改善MK-7合成过程中辅因子失衡的问题。![]()
图4 NADH激酶介导NADH转化为NADPH
下一步验证辅因子再生NADPH的影响。在BS008中同时用强启动子Phbs融合zwf，用P43融合截短的pos5P，得到BS010和BS011，MK-7产量分别为43.24和53.07mg/L，比BS008高出11%和36%，且生长趋势相同。测量胞内吡啶核苷酸浓度，BS008的NADH水平是BS168的1.34倍，辅因子提高后，BS010和BS011胞内NADPH水平比BS008各提高9.7%和20.55%，NADH下降了7.7%和21.15%。表明使用NADH激酶介导NADPH再生策略比增强内源辅助因子更有效。因此，选择BS011作为MK-7合成菌株。测定修饰基因的相对表达量，qRT-PCR显示BS011中过表达基因转录水平显著高于BS168，dxs和menA最为显著，达到9倍和12倍，pos5P表达量更高，所有修饰基因均成功过表达。![]()
图5 改进辅因子再生对MK-7合成的影响
最后考察辅因子再生引起的碳代谢分配。枯草芽孢杆菌中，丙酮酸是中心碳代谢节点。在碳代谢高或NADH积累时，丙酮酸形成溢出代谢物，如乳酸盐、醋酸盐和乙醇。这些依赖NADH的副产物消耗额外碳源降低了经济性。测量BS011发酵液中乳酸和醋酸盐的浓度，发现无论是野生型还是重组菌都没有明显的乙酸积累。BS011的乳酸生成量略有下降，为4.48g/L，比BS008低9.15%。表明辅因子再生引起了碳代谢重新分配，使辅因子能循环利用，避免了不必要的能量浪费。![]()
图6 辅因子再生后BS011代谢通量再分配
本研究采用自下而上的合成生物学方法，构建了高效、低碳、辅因子循环的MK-7合成菌株。通过过表达限速酶促进碳代谢向合成通路流动，利用数据库筛选NADPH再生的关键酶Pos5P帮助NADH转化为NADPH，获得氧化还原平衡菌株BS011的MK-7产量为53.07mg/L，是野生型的4.52倍。该策略为开发复杂途径和氧化还原不平衡的萜类合成菌株提供了参考。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1186/s12934-022-01823-3
枯草芽孢杆菌是食品、饲料安全菌种，具有易培养、高效表达（或分泌表达）蛋白等优势。淳瑶生物研发的MATE枯草表达系统，拥有多种“表达质粒-宿主菌种”搭配方案，针对不同类型目的蛋白进行胞内、胞外特异性优化，实现目的蛋白“高表达”（占总蛋白60%以上表达量，分泌胞外蛋白量超过80%），“高严谨”（可达790倍诱导倍数），和“耐葡萄糖”（20g/L葡萄糖条件下表达强度不变），并具有自主知识产权和发明专利群，可以广泛应用食品、饲料、医药等领域。
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