异麦芽酮糖是由葡萄糖和果糖通过α-1，6-糖苷键连接形成的二糖，可作为蔗糖替代品，具有消化慢、甘氨酸指数低、能量释放时间长、胰岛素反应弱、致癌性低等优点。工业上通过蔗糖异构酶(SIase)合成，在食品和药品领域应用广泛。南京工业大学徐虹和李莎研究团队在Bioprocess and Biosystems Engineering上发表题为Economical production ofisomaltulose from agricultural residues in a system with sucrose isomerase displayed on Bacillus subtilis spores的文章，将源于大黄欧文氏菌NX-5的蔗糖异构酶(SIase)展示在枯草芽孢杆菌168的孢子表面，显示出很高生物活性和热稳定性。以30g/L甜菜糖蜜和50g/L冷榨豆粉为工业培养基，孢子的蔗糖转化率能达到92%，且在6个周期后仍剩余45%。该系统利用农业残留物生产异麦芽酮糖，具有良好的成本效益。![]()
首先利用在线工具按照枯草芽孢杆菌的蛋白表达偏好优化SIase编码基因palI的序列，优化后部分碱基发生改变，编码的氨基酸未改变，蛋白质序列与原始序列相同。将palI与大肠杆菌外膜蛋白基因cotX融合，构建重组质粒pJS700a-cotX-palI，经限制性内切酶酶切验证并测序表明载体构建正确。![]()
图1 重组质粒的构建及鉴定
将重组质粒转化到枯草芽孢杆菌168中，融合基因整合到染色体的淀粉酶amyE位点，破坏了淀粉酶的表达。在含淀粉LB平板上的菌落被碘化钾染色后变成蓝色，而野生型淀粉酶表达正常，淀粉水解后菌落仍为原来的颜色。将阳性工程菌株被命名为枯草芽孢杆菌168-SIase。在表面展示系统中，菌株产孢和SIase表达同时被cotX特异性启动子启动，生成异麦芽酮糖浓度为11.6g/L，表面展示SIase活性为1.69×10-3U/mL或2.01×10-12U/孢子。可见，枯草芽孢杆菌的孢子是适宜载体。![]()
图2 通过淀粉酶活性鉴定阳性重组菌株
接着利用农业残留物优化SIase生产。用未处理甜菜糖蜜（UBM）作碳源，细菌OD值达到9.45，SIase活性为2.25×10-2U/mL。用10g/L冷榨豆粉（SP）作氮源，SIase活性为3.43×10-2U/mL，与蛋白胨差异很小而成本大幅降低。调节二者浓度，在30g/L初始UBM下酶活性最大，为3.59×10-2U/mL，之后活性下降，可能与孢子数量减少有关。SP浓度为50g/L时，细菌OD达到最高值16.2，酶活性为4.13×10-2U/mL。加入适当浓度无机盐，在pH7.0下，30g/L UBM和50g/L SP为碳氮源，重组菌OD值达到31.7，SIase活性约为7.2×10-2U/mL。![]()
图3 不同浓度碳氮源下菌量和SIase产量
继续在7.5L生物反应器中进行30g/L UBM和50g/L SP的补料分批发酵。结果表明，24h时SIase活性最高，达到0.218U/mL。通过光学显微镜观察，几乎所有细菌的孢子中间都变成透明状，且孢子生长迅速，数量达1.07×1010个，细菌OD值达到91.3。说明UBM和SP的添加有利于细胞的生长，孢子的形成和较高的SIase活性，为最大限度提高孢子数量提供了培养条件。中试生产为工业化奠定了基础，该系统是一种经济、环保的SIase生产方法。![]()
图4 7.5L反应器中生长曲线和活性
酶的稳定性是影响酶生物转化长期商业应用的重要因素。之前研究表明，SIase对温度和pH的变化很敏感。使用50g/L蔗糖为底物，在30℃和pH6时测得SIase相对活性达到最高。在25~45℃范围内，表面展示型SIase的相对活性保持在最高水平的85%以上，在pH5.0~7.0范围内，也能保持在最高水平的85%以上。可见，与大肠杆菌的重组SIase相比，该酶在枯草芽孢杆菌中表达后热稳定性有所提高，更利于工业上的应用。![]()
图5 温度和pH对表面展示SIase的影响
进一步考察该酶的热稳定性。在40℃和45℃孵育60min后活性没有明显下降，在50℃孵育60min后活性仍维持最高水平的60%。因此，表明展示SIase在较宽的温度和pH范围内对蔗糖进行生物转化，比游离酶更适合工业应用。![]()
图6 表面展示SIase的热稳定性
随后分析孢子剂量对生物转化反应的影响。为使异麦芽酮糖产量达到最大，通常选择500g/L蔗糖作为异麦芽酮糖生产浓度。将200-500mL不同剂量孢子发酵液添加到含500g/L蔗糖的体系中。结果表明，孢子的最佳剂量是在30℃生物转化24h时从400mL发酵液中获得的悬浮液，对应于约92%的异麦芽酮糖产量。时相实验表明，转化在6h内达到平衡，底物蔗糖几乎完全转化，转化率92%。![]()
图7 重组孢子剂量和酶促反应时间
最后，在最优转化条件下对孢子表面展示SIase进行重复使用实验。孢子表面展示的SIase通过离心分离，然后用0.1M磷酸钠缓冲液洗涤，进行下一次循环。结果表明，SIase的活性在第6个周期后开始下降，约为初始活性的37%。在6个反应循环中，生物转化率为45%。同时，残留的孢子数量在六次循环后显著减少，只保留了初始数量的34%。![]()
图8 表面显示SIase的多次循环利用
本研究建立了一种利用农业残渣生产异麦芽酮糖的生物转化方法。将源于大黄欧文氏菌NX-5的SIase在枯草芽孢杆菌168孢子表面展示，得到菌株168-SIase。分别以UBM和SP为碳氮源时，SIase活性达到最大值0.218U/L。以500g/L蔗糖为底物，经过6个循环的重复分批反应，蔗糖转化率超过92%。该方法提高了SIase的转化活性和稳定性，为食品工业中异麦芽糖商业化生产提供了新思路。相关论文信息：
https://doi.org/10.1007/s00449-019-02206-6
枯草芽孢杆菌是食品、饲料安全菌种，具有易培养、高效表达（或分泌表达）蛋白等优势。淳瑶生物研发的MATE枯草表达系统，拥有多种“表达质粒-宿主菌种”搭配方案，针对不同类型目的蛋白进行胞内、胞外特异性优化，实现目的蛋白“高表达”（占总蛋白60%以上表达量，分泌胞外蛋白量超过80%），“高严谨”（可达790倍诱导倍数），和“耐葡萄糖”（20g/L葡萄糖条件下表达强度不变），并具有自主知识产权和发明专利群，可以广泛应用食品、饲料、医药等领域。
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