CRISPR/Cas系统是古细菌长期演化形成的一种免疫系统，可以识别切断外源DNA并沉默表达。由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统已被开发成一种高效的基因组编辑工具，实现靶基因精确插入和删除，是多基因整合到枯草芽孢杆菌染色体的理想方法。德国斯图加特大学Hildegard Watzlawick研究团队在AMB Express上发表题为Multiple integration ofthe gene ganA into the Bacillus subtilis chromosome for enhanced β-galactosidase production using the CRISPR/Cas9 system的文章，利用CRISPR/Cas9系统将β-半乳糖苷酶基因ganA与葡萄糖醇启动子融合，整合进枯草芽孢杆菌染色体1~5个不同位点，其中携带5个基因表达盒菌株的酶活性为8.36U/mg，与质粒表达相似，并且在无抗生素下至少产生40代半乳糖苷酶，表明CRISPR/Cas9系统是一种有价值且简单的构建稳定高产菌株的工具。![]()
首先利用pJOE8386.1穿梭质粒构建表达载体。该质粒包括pUB110复制起点的卡那抗性基因及pIC20HE起点的氨苄抗性基因，并携带一个含葡萄糖醇诱导启动子Pgut的egfp基因表达盒。通过PCR从枯草芽孢杆菌染色体DNA中扩增出ganA基因，插入到pJOE8386.1的BamHI和BsrGI位点之间，在启动子上游和ganA下游引入终止子，删除eGFP，得到pHWG1132。在Pgut和ganA之间插入gsiB翻译起始序列，以实现ganA的高效翻译。利用该质粒转化枯草芽孢杆菌菌株REG19。![]()
图1 表达载体pHWG1132的构建
接着构建CRISPR/Cas9载体，将间隔序列克隆到pJOE8999中，Cas9靶向要删除的区域。PCR扩增pHWG1132中Pgut-ganA序列，末端添加与载体一致的SfiI位点，并将3个PCR片段与载体一次性连接。利用该方法生成的CRISPR/Cas9载体pJOE9898.1、pJOE9899.2、pJOE9918.5、pJOE9957.1和pJOE9974.2，对REG19进行转化。将Pgut-ganA表达盒依次插入染色体xylA和pit，fabI和yjcD，yitR和yitS，ywrK和ywrD以及ycgB和ldh五个区域之间，删除其中不影响生长的基因。分别得到JA-BS34~37和JA-BS40五株整合1~5次的菌株。![]()
图2 Pgut-ganA盒整合进染色体的各个位点
随后采用对硝基苯-β-D-半乳糖吡喃苷(pNP-βGal)测定半乳糖苷酶活性。将LB中固定培养过夜的细胞用0.5%葡萄糖稀释至OD值0.05，在200rpm和37℃摇瓶中生长16h。收集细胞后重悬在pH6.5的0.1M磷酸钠缓冲液中超声裂解。以pNP-βGal为底物测定细胞粗提物的GanA活性。菌株REG19在gan操纵子中含有一个ganA拷贝，但仅通过半乳聚糖诱导天然gan启动子转录。以每毫克蛋白质为单位的特定β-半乳糖苷酶活性显示，REG19中该拷贝在实际使用时几乎不产生活性。![]()
图3 含0~5拷贝表达盒菌株的酶活性
在含有Pgut-ganA盒拷贝的各菌株中，随着拷贝数的增加，β-半乳糖苷酶活性也有增加，但增加的速度与拷贝数不成正比，明显低于预期。菌株JA-Bs40的活性约8.36U/mg，与葡萄糖醇诱导的REG19/pHWG1132细胞活性9.83U/mg相当。在用葡萄糖生长的菌株中，β-半乳糖苷酶活性比预期的低20倍。各菌株粗提物的SDS-PAGE显示的79.8kDa蛋白条带，与GanA的分子量相对应且逐渐突出。![]()
图4 各菌株蛋白粗提物的SDS-PAGE
进一步比较菌株JA-Bs40和REG19/pHWG1132在添加葡萄糖醇诱导和质粒无抗生素筛选条件下生产GanA的稳定性。将两种菌株在LB过夜培养后，按1:1000接种在含0.5%葡萄糖醇的LB摇瓶中，生长至静止期后再次稀释1000倍，重复3次。每次到达静止期时，测定β-半乳糖苷酶活性。结果表明，菌株JA-Bs40在同一时间内连续产生了相同量的GanA。相比之下，REG19/ pHWG1132在未添加抗生素时，即使第一轮生长到静止期约9代后，也只有约20%的酶活性，稀释后继续下降，到最后一轮结束时几乎无活性。用此时的细胞做耐药性测试，70个单菌落都不能在卡那霉素平板上生长，这表明质粒丢失的频率很高。![]()
图5 JA-Bs40和REG19/pHWG1132梯度稀释后的酶活性
本研究利用CRISPR/Cas9系统将ganA基因整合进枯草芽孢杆菌染色体，构建稳定的β-半乳糖苷酶生产菌株。结果表明，携带5个基因表达盒的重组菌半乳糖苷酶活性达到8.36U/mg，并能稳定传代至少40代，表明利用CRISPR/Cas9多基因整合实现酶过量生产，是一种避免耐药基因、快速、易于操作的方法。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1186/s13568-019-0884-4
枯草芽孢杆菌是食品、饲料安全菌种，具有易培养、高效表达（或分泌表达）蛋白等优势。淳瑶生物研发的MATE枯草表达系统，拥有多种“表达质粒-宿主菌种”搭配方案，针对不同类型目的蛋白进行胞内、胞外特异性优化，实现目的蛋白“高表达”（占总蛋白60%以上表达量，分泌胞外蛋白量超过80%），“高严谨”（可达790倍诱导倍数），和“耐葡萄糖”（20g/L葡萄糖条件下表达强度不变），并具有自主知识产权和发明专利群，可以广泛应用食品、饲料、医药等领域。
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