乳糖-N-新四糖(LNnT)是母乳寡糖的关键成分之一，具有增强免疫、调节肠道菌群、促进细胞成熟的生物学功能，对婴幼儿非常有益。目前通过化学合成的方法进行大规模生产，商业化成本极高。因此，利用枯草芽孢杆菌生物合成引起了众多研究者的关注。江南大学刘龙和王淼研究团队在Biotechnology for Biofuels上发表题为Modular pathway engineering ofkey precursor supply pathways for lacto-N-neotetraose production in Bacillus subtilis的文章，在枯草芽孢杆菌中重新构建了LNnT的合成途径，微调LgtB表达减少细胞生长抑制，再通过模块化调控平衡UDP-GlcNAc和UDP-Gal的供应，使LNnT滴度上升至1.95g/L。在3L反应器中采用葡萄糖和乳糖饲喂策略发酵，滴度最终达到4.52g/L。本研究通过优化酶表达水平和模块化途径工程平衡前体供应，显著提高枯草芽孢杆菌LNnT的生物合成量。
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枯草芽孢杆菌中，LNnT的合成通路大致为：UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)和乳糖被β-1,3- N-乙酰氨基葡萄糖苷转移酶LgtA催化生成乳糖-N-丙糖II (LNTII)，然后LNTII和UDP-半乳糖(UDP-Gal)被β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB催化生成LNnT。有两个关键因素会影响LNnT的合成效率，一是外源蛋白的共过表达可能会抑制细胞生长，使菌体密度降低。二是UDP-GlcNAc和UDP-Gal两种关键前体的供应是否充足。![]()
图1 枯草芽孢杆菌LNnT生物合成通路
首先考察外源蛋白共表达对细菌生长的影响。将源于脑膜炎奈瑟菌的lgtA和lgtB基因，在组成型强启动子P43控制下，整合进基因组得到菌株BY02，同时构建pP43NMK质粒表达系统得到BY03。二者的LNTII滴度均低于检测水平，说明LgtA表达量不足以合成LNnT。当LgtB表达量最高时，LNnT滴度为0.61g/L，比BY02显著提高12.2倍，但最大DCW和葡萄糖消耗率显著降低48.8%和16.1%，可能是两个异源蛋白一起过表达阻滞了细胞生长。进一步在P43下将1~4个lgtB拷贝整合进基因组，同时用pP43NMK表达LgtA，获得BY04~08。其中BY06的LNnT滴度最高为1.31g/L，比BY03提高114.8%，DCW也增加至11g/L，葡萄糖LNnT产量为24.4mg/g葡萄糖，产率2.5mg/gDCW/h。当乳糖加倍到10g/L时，LNnT产量没有进一步增加，说明5g/L的乳糖足够。而BY06的LNnT II很低，推测胞内前体供应仍不足。![]()
图2 lgtA和lgtB基因不同表达水平的影响
继续探索如何平衡两种前体的供应。先验证Pgi的作用，Pgi是一种双向酶，相互转化果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸。单纯过表达pgi的BY08中，LNTII滴度上升至0.13g/L，LNnT下降至1.05g/L，表明上调pgi可以使UDP-GlcNAc通路流量增强。在BY04中过表达pgi后（BY13），LNnT较BY04提高26.3%，而在BY06中过表达后（BY08）反而降低，表明pgi是合成途径中的有效酶。以BY04为宿主分别过表达UDP-Gal模块中的pgcA(BY14)、gtaB(BY15)、galE(BY17)或敲除tuaD(BY16)，LNnT滴度由0.76g/L分别增加到1.01g/L、0.92g/L、0.81g/L和1.0g/L。这表明两个前体不足确实限制了LNnT合成，过表达正作用酶或缺失分支途径酶会使产量增加。![]()
图3 UDP-GlcNAc和UDP-Gal通路中正作用酶的鉴定
进一步组合两个模块中要过表达或缺失的基因，每个模块都设计成低、中、中+和高四种强度水平，排列组合得到BY18~33共16株重组菌，比较不同组合的效果。当UDP-Gal模块在低或中+水平时，UDP-GlcNAc的水平增加会使LNTII滴度逐渐上升。当UDP-GlcNAc模块保持中+水平，UDP-Gal模块在低、中和中+水平增加时，LNnT滴度分别为1.29、1.32和1.95g/L。当UDP-Gal处于中等水平、UDP-GlcNAc在低水平时，LNnT滴度为1.35g/L，提升UDP-Gal模块至中+或高水平，LNnT反而下降至1.30和1.0g/L，说明此时UDP-Gal供应不是限速步骤，该模块加强后导致两个模块不平衡，使滴度降低。相反，将UDP-GlcNAc提高到中强度后，LNnT滴度上升至1.75g/L。可见，通过模块工程策略使UDP-GlcNAc和UDP-Gal供应平衡是高效合成LNnT的关键。![]()
图4 两供应模块组合对LNnT合成的影响
与对照菌株BY06相比，BY28在中+水平同时控制UDP-Gal和UDP-GlcNAc模块，显著提高了LNnT滴度达到1.95g/L，葡萄糖LNnT产量为32.5mg/g葡萄糖，提高33.2%，产率为3.07mg/gDCW/h，提高23.3%。同时，菌株BY28的最大DCW达到13.2g/L，比BY06提高了20%。因此，模块途径工程的两种前体的供应和平衡对高效生产LNnT至关重要。另外，BY28胞外LNT II的积累量为1.19g/L，表明LgtB酶在BY28中的催化能力可能不足。但LgtB表达增加可能会对细胞蛋白合成系统造成压力，降低LNnT合成效率。因此，可以通过酶工程策略提高LgtB的催化效率，从而进一步增加LNnT产量。![]()
图5 最适组合BY28与初始BY06比较
最后通过两种策略在3L反应器中生产LNnT。在间歇补料策略下，发酵72h添加葡萄糖和乳糖共计220mL，最大DCW约14.5g/L，LNnT和LNT II滴度分别约为3.68g/L和1.77g/L。葡萄糖LNnT产量和产率为40.4mg/g和3.52mg/gDCW/h。在控制葡萄糖、乳糖浓度的双流连续补料策略下，培养72h共添加310mL进料液，最大DCW约14.7g/L，LNnT和LNTII滴度分别为4.52g/L和2.64g/L，葡萄糖LNnT产量和产率分别为41.9mg/g和4.27mg/gDCW/h。可见，发酵液中葡萄糖和乳糖浓度过高会导致LNnT合成效率降低，双流连续补料策略更为适合。BY28生产LNnT和LNTII的总效价达到7.16g/L，高于大肠杆菌JM109的5g/L，并且能释放到发酵液中，便于分离。因此，枯草芽孢杆菌比大肠杆菌更适合LNnT的工业化生产。![]()
图6 BY28在3L反应器中生产LNnT
本研究通过优化LgtA和LgtB的表达水平及组合两个关键前体合成模块，实现了LNnT的高效合成。摇瓶培养LNnT的滴度由0.05逐步提高至1.95g/L，在3L反应器中通过双流连续补料策略最终提高至4.52g/L。本研究表明外源蛋白表达水平优化和合成途径模块化对于提高枯草芽孢杆菌LNnT产量非常有效，该策略也可用于生产其他有价值的寡糖。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1186/s13068-019-1551-3
枯草芽孢杆菌是食品、饲料安全菌种，具有易培养、高效表达（或分泌表达）蛋白等优势。淳瑶生物研发的MATE枯草表达系统，拥有多种“表达质粒-宿主菌种”搭配方案，针对不同类型目的蛋白进行胞内、胞外特异性优化，实现目的蛋白“高表达”（占总蛋白60%以上表达量，分泌胞外蛋白量超过80%），“高严谨”（可达790倍诱导倍数），和“耐葡萄糖”（20g/L葡萄糖条件下表达强度不变），并具有自主知识产权和发明专利群，可以广泛应用食品、饲料、医药等领域。
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