表面活性素是一种脂肽，由一个C12~C19脂肪酸链和四种氨基酸经缩合反应形成，是高效的表面活性剂，有抗菌、抗病毒和抗肿瘤活性，应用于石油开采、生物农药、食品加工和制药等领域。表面活性素可以由天然枯草芽孢杆菌合成，但工业应用仍然受到产量低的限制。天津大学宋浩教授团队在Microbial Cell Factories上发表题为Enhancing surfactin production by using systematic CRISPRi repression to screen amino acid biosynthesis genes in Bacillus subtilis的文章，利用CRISPRi技术抑制枯草芽孢杆菌氨基酸合成分支途径，使转录水平下降2.5~627倍，大部分重组菌的表面活性素产量上升，将效用最大的yrpC、racE和murC三个基因联合抑制，yrpC和racE共抑制菌株表面活性素产量为0.75g/L，是亲本菌株的4.69倍。这是首次系统研究增加氨基酸供应对表面活性素产量的影响，为研究该类氨基酸衍生品提供了新视角。![]()
表面活性素含两个酸性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、五个非极性氨基酸（亮氨酸和缬氨酸）和一个C12~C19β-羟基脂肪酸链。合成分为脂肪酸的生物合成，四种氨基酸生物合成及7个氨基酸通过表面活性素合成酶依次组装到脂酰CoA三个过程。在前体供应方面，过表达脂肪酸合成途径相关基因，增加脂肪酸供应能提高表面活性素滴度至4.9g/L。另一方面，氨基酸也是合成必需前体，增加氨基酸供应可通过降低其合成分支途径的代谢通量来实现，也可能提高表面活性素产量。![]()
图1 枯草芽孢杆菌表面活性素的生物合成
首先在枯草芽孢杆菌168中建立表面活性素合成途径。将完整的sfp基因整合到野生菌株的ydeO位点，获得重组菌BS168NU-S，表面活性素产量为0.45g/L。构建CRISPRi系统抑制氨基酸合成分支途径，其中dCas9在木糖启动子Pxyl控制下表达，并整合到基因组lacA位点。sgRNA由组成型启动子Pveg表达，整合到amyE位点。选择分支通路上的20个基因单独干扰，检测相对转录水平发现，mmgA、yhfS、yrpC、murC和bkdAA的抑制效率为2.5~7.2倍，其他基因都抑制10倍以上，尤其是asnH、nadB、yhdR、pyrC和bkdAB的转录水平下降超过150倍，这表明CRISPRi系统有效地抑制了靶基因表达。![]()
图2 CRISPRi系统构建及抑制效率
接着研究单基因抑制对表面活性素的影响。将dCas9整合到BS168NU-S的lacA位点得到BS168NU-Sd作为对照。在含4g/L木糖的培养基中接种24h，测定表面活性素产量和细胞密度。BS168NU-Sd的表面活性素滴度仅0.17g/L，低于BS168NU-S的0.37g/L，这是由高表达的dCaS9蛋白毒性所致。尽管如此，仍有16个单基因抑制菌株的产量增加，特别是L-谷氨酸消耗相关基因yrpC、racE和murC被抑制后，产量分别为0.54、0.41和0.42g/L，且murC抑制株产率最高达到0.083g/L/OD。在接种后间隔6h测量BS168NU-Sd、yrpC、racE和murC的活性素产量和细胞生物量。yrpC和racE的生长速度更快，murC滞后期长，生物量略低，但最大生长速率和容积生产率均高于对照。3个工程菌株消耗蔗糖更多，有较高的中心代谢和底物利用率。![]()
图3 单基因抑制对表面活性素产量的影响
就脂肪酸碳链长度与肽段的结构含量而言，表面活性素是混合物。C14表面活性素的起泡能力和质量高于C13和C15。与BS168NU-Sd相比，抑制bkdAA或bkdAB后不仅增加了活性素产量，而且显著改变了各组分的比例。C14活性素的比例分别从BS168NU-S的25.7%或BS168NU-Sd的18.7%增加至82.4%或85.1%。bkd操纵子使用L-亮氨酸为前体催化合成异C13和异C15脂肪酸。抑制bkdAA和bkdAB后不仅增加了L-亮氨酸和L-缬氨酸的积累，而且通过中断bkd操纵子减少了异C13和异C15脂肪酸的合成。![]()
图4 抑制bkdAA和bkdAB对表面活性素组成的影响
最后研究三个基因的共抑制作用。构建多基因抑制sgRNA质粒，转化后发酵24h测定产量和细胞密度。结果表明，同时抑制两个基因时，活性素产量可进一步提高，分别达到0.75、0.57和0.48g/L，且单位OD产量也增加。但同时抑制3个基因后，表面活性素仅产生0.07g/L，低于单基因抑制。这可能是由于共同抑制会导致细胞生长显著恶化。通过共抑制4种氨基酸合成分支途径基因，得到了6株表面活性素产量明显提高的重组菌株。其中yrpC和racE共抑制菌株产量最高为751.90mg/L，容积生产率31.33mg/L/h，是BS168NU-Sd的4.51倍，碳产率为3.54mmol/mol蔗糖，是BS168NU-Sd的4.43倍，与BS168NU-S相比也均提高了2倍以上。![]()
图5 多基因抑制对表面活性素产量的影响
本研究在枯草芽孢杆菌中构建了一个高效的CRISPRi系统，分别抑制BS168NU-S中4条氨基酸合成分支代谢通路上20个核心基因，其中16个基因抑制后增加了表面活性素产量。与L-谷氨酸代谢相关的yrpC、racE或murC抑制后增加最为显著。进一步将3种基因联合抑制后，yrpC和racE共抑制菌株表面活性素滴度最高为751.90mg/L，比初始菌株提高2倍以上。因此，通过CRISPRi系统抑制分支途径以增加氨基酸前体供应，是提高枯草芽孢杆菌表面活性素产量的有效策略。相关论文信息：
https://doi.org/10.1186/s12934-019-1139-4
枯草芽孢杆菌是食品、饲料安全菌种，具有易培养、高效表达（或分泌表达）蛋白等优势。淳瑶生物研发的MATE枯草表达系统，拥有多种“表达质粒-宿主菌种”搭配方案，针对不同类型目的蛋白进行胞内、胞外特异性优化，实现目的蛋白“高表达”（占总蛋白60%以上表达量，分泌胞外蛋白量超过80%），“高严谨”（可达790倍诱导倍数），和“耐葡萄糖”（20g/L葡萄糖条件下表达强度不变），并具有自主知识产权和发明专利群，可以广泛应用食品、饲料、医药等领域。
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