天然维生素K包括植物叶绿醌和细菌甲基萘醌，其中甲基萘醌-7 (MK-7)的生物活性更强，被广泛用作食品、制药和医疗保健行业的膳食补充剂，以预防骨质疏松、心血管钙化和帕金森病，市场前景广阔。MK-7的生物合成受到学术界和工业界的高度重视。天津大学宋浩教授团队在上发表题为Modular Pathway Engineering of Bacillus subtilis To Promote De Novo Biosynthesis of Menaquinone-7的文章，以枯草芽孢杆菌168作为底盘，通过代谢工程设计，调节MK-7生物合成的四个模块，增加前体供应并减少旁路消耗，最终重组菌株MK3-MEP123-Gly2-ΔdhbB的MK-7产量可达到38.9mg/L，是初始菌株的3.2倍。添加甘油和大豆蛋白胨后，产量可进一步增加到69.5mg/L。![]()
枯草芽孢杆菌中MK-7的生物合成途径分为MK-7途径、莽草酸(SA)途径、甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)途径和甘油代谢途径四个模块。MK-7是电子传递链中由分支酸合成的非蛋白组分。MK-7途径包括9个酶促反应。前6种酶的编码基因构成menFDHBEC操纵子，基因menG与hepS/hepT一起构成hepS-menG-hepT操纵子。![]()
图1 MK-7生物合成途径的四个模块
首先尝试提高MK-7通路的代谢通量。将起始菌株BS168NU中menFDHBEC和hepS-menG-hepT的启动子替换为PlapS，获得重组菌MK1和MK4，过表达menI和menA得到MK2和MK3。发酵后发现过表达对细胞生长影响不明显，MK1中目的基因转录水平提高2.4倍，但MK-7的产量变化不大。可见由该操纵子编码的6种酶不是限制合成瓶颈。MenI过表达也没有提高产量。而MK3产生MK-7浓度为6.6mg/L，是BS168NU的2.1倍。可见MenA催化的第八个反应是一个限速步骤。MK4可以产生4.3mg/L的MK-7，是BS168NU的1.4倍。然而，MK34中两个操纵子组合过表达会导致细胞生长和MK-7产生减少。因此，选择MK3进行下一步改造。![]()
图2 提高MK-7途径的代谢通量
MK-7通路由SA通路的关键中间体分支酸启动，其中3-脱氢莽草酸还原为SA是主要限速步骤。过表达aroA和aroD后SA产量为3.2g/L。分别过表达DAHP合成酶aroA、SA脱氢酶aroD、SA激酶aroK和羧乙烯基转移酶aroE四个基因增加分支酸供应。然而，除AroK过表达使MK-7轻微增产5%外，其他三种酶过表达后反而抑制合成。qRT-PCR显示四个基因的转录水平确实显著升高，且不影响细胞生长。之前研究发现芳香氨基酸Tyr、Phe和Try会显著降低MK-7产量。过表达AroA、AroD和AroE可能会增加芳香氨基酸合成，导致SA通路的反馈抑制，因此该通路不做修饰。![]()
图3 设计SA通路增强分支酸供应
枯草芽孢杆菌中，由menA驱动的DHNA向DMK戊烯化是MK-7合成限速步骤，因此，增加Hepta-PP的供应也很重要。用P43分别过表达MK3基因组中的dxs、dxr、yacM-yacN、ispE、yqfP和yqiD，得到菌株MK3-MEP1~6。Dxs催化生产DXP是MEP途径的第一个反应，dxs过表达菌株MK3-MEP1发酵120h后MK-7产量为9.7mg/L，比MK3提高47%，且转录水平是MK3的2.4倍。Dxr催化DXP还原为MEP是第二个反应。过表达dxr的菌株MK3-MEP2的产量比MK3提高38%，达到9.1mg/L。过表达yacM/yacN的菌株MK3-MEP产量为8.8mg/L，增加33%。可见，Dxs、Dxr、YacM和YacN都是促进MK-7合成的关键酶。将这些基因组合过表达，得到菌株MK3-MEP123的MK-7产量为12.0mg/L。![]()
图4 改善MEP途径中庚戊基PP供应
细菌对甘油的摄取由膜通道蛋白GlpF催化，异化过程主要包括甘油激酶GlpK和甘油-3-磷酸脱氢酶GlpD转化为二羟基丙酮磷酸DHAP。枯草芽孢杆菌中glpF和glpK是一个操纵子，后面接glpD，前面的glpP调节glpFK和glpD表达。此外，glpFK操纵子由Gly-3P诱导，并受到快速代谢糖的抑制。分别将glpFK、glpD插入基因组的pksJ位点，tpi插入pksL位点，并用P43过表达，获得菌株MK3-MEP123-Gly1~3，其中1和3的产量增长不显著。菌株MK3-MEP123-Gly2的MK-7产量达到13.7mg/L，提高了14%，且该菌株发酵96h后可以消耗甘油，比MK3-MEP123更快，适用于后续实验。![]()
图5 甘油代谢途径模块的改造
乳酸脱氢酶Ldh将丙酮酸转化为乳酸，缺失后对细胞生长和MK-7合成影响不明显。乙酰乳酸合成酶AlsS和乙酰乳酸脱羧酶AlsD将两分子丙酮酸转化为乙偶姻，alsS-alsD缺失阻碍细胞生长。分支酸参与三种芳香氨基酸和叶酸的合成。aroH缺失后阻断了Tyr和Phe合成，但使分支酸积累引发负反馈抑制，产量反而降低。pabB-pabA缺失后消除了叶酸合成，对产量仅有轻微影响。枯草芽孢杆菌利用2,3-二羟基苯甲酸酯DHB为铁载体。dhbB缺失后将分支酸驱动到MK-7途径，使产量提高到13.4mg/L，增加约12%。结合之前的修饰，最终重组菌株MK3-MEP123-Gly2-ΔdhbB的MK-7产量能达到15.4mg/L。![]()
图6 减少丙酮酸、分支酸和异分支酸消耗
最后将初始菌株BS168NU和最终重组菌MK3-MEP123-Gly2-ΔdhbB在2L隔板烧瓶中发酵，48h后细胞生长达到最大，72h后重组菌的MK-7产量为38.9mg/L，是起始菌株12.3mg/L的3.2倍。将48h的发酵液离心，测得初始菌株上清液中MK-7浓度为3.2mg/L，占总产量的45%，重组菌则为5.3mg/L，占总产量的25%。维生素K2结合因子为酸性糖缀合物，可能限制向外分泌。静止期延长有利于代谢物积累，在发酵48h和96h时，各添加1%甘油和2%大豆蛋白胨，重组菌生长的稳定期延长，发酵144h后，MK-7产量为69.5mg/L，上清液中约占25%。因此，对枯草芽孢杆菌代谢工程改造以提高产量具有巨大的经济效益。![]()
图7 在2L烧瓶中发酵生产MK-7
本研究选择枯草芽孢杆菌168进行模块化代谢工程设计提高MK-7产量。在4个模块中过表达16个基因，替换两个启动子，并敲除7个基因，发现menA、dxs、dxr、yacM、yacN、glpD和dhbB是合成的关键基因。最终菌株MK3-MEP123-Gly2-ΔdhbB在2L烧瓶中发酵72h，MK-7产量达到38.9mg/L，添加2%甘油和4%大豆蛋白胨后稳定期延长，产量能达到69.5mg/L。枯草芽孢杆菌高密度发酵技术的发展还将进一步提高产量。
相关论文信息：
http://doi.org/10.1021/acssynbio.8b00258
枯草芽孢杆菌是食品、饲料安全菌种，具有易培养、高效表达（或分泌表达）蛋白等优势。淳瑶生物研发的MATE枯草表达系统，拥有多种“表达质粒-宿主菌种”搭配方案，针对不同类型目的蛋白进行胞内、胞外特异性优化，实现目的蛋白“高表达”（占总蛋白60%以上表达量，分泌胞外蛋白量超过80%），“高严谨”（可达790倍诱导倍数），和“耐葡萄糖”（20g/L葡萄糖条件下表达强度不变），并具有自主知识产权和发明专利群，可以广泛应用食品、饲料、医药等领域。
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