维生素K促进血液凝固，在骨骼和心血管健康中发挥重要作用。甲基萘醌-7(MK-7)是维生素K的一种形式，在循环中的半衰期长。MK-7难以通过有机化学合成，一般利用微生物发酵生产，其中通过枯草芽孢杆菌代谢工程提高MK-7产量具有相当大的潜力。澳大利亚悉尼大学Nicholas V. Coleman研究团队在ACS Synthetic Biology上发表题为Metabolic Engineering of the MEP Pathway in Bacillus subtilis for Increased Biosynthesis of Menaquinone-7的文章，对枯草芽孢杆菌进行代谢工程改造，对限速酶Dxs、Dxr、Idi和MenA做不同的过表达组合，构建了12株重组菌。表现最好的菌株中，MK-7的产量提高了11倍，达到50mg/L，充分显示了枯草芽孢杆菌在高价值化合物工业生产中的有用性。同时，代谢物分析表明IspG和IspH是合成通路的新瓶颈，为进一步优化提供了方向。![]()
MK-7的生物合成比较复杂，包括甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)途径组装C35类异戊二烯尾部，莽草酸(SA)途径提供芳香头部，最后在甲基萘醌途径制造最终产物。MEP途径也称为类异戊二烯途径，被认为是MK-7产生的速率限制。这一途径已被深入研究用于生产半萜、单萜、倍半萜、二萜、类胡萝卜素、泛醌和甲基萘醌等。Dxs和Dxr两种酶一直被认为是MEP途径中的限速酶，也有证据表明Idi酶也是限速酶，连接类异戊二烯尾部和芳香头部的酶UbiA/MenA似乎是合成下游的限速酶。![]()
图1 枯草芽孢杆菌MK-7生物合成途径
本研究首先在IPTG诱导启动子Pspac的pUS258质粒上，插入不同限速酶基因构建过表达载体，再排列成各种基因簇，转化枯草芽孢杆菌后检测MK-7产量。随后检查合成重组的代谢物谱，以确定未来设计-构建-评估-优化(DCEO)循环迭代的途径瓶颈。![]()
图2 插入pUS258质粒的各基因簇示意图
先增加MEP通路基因的碳通量，分别或共同过表达基因dxs、dxr和idi，并通过双交叉同源重组整合到染色体的amyE位点。与空质粒相比，单基因过表达dxs、dxr或idi分别使MK-7产量增加3.7、2.1和2.5倍。当dxs和dxr共同过表达时，产量增加4.6倍，比单独过表达分别增加1.2和2.3倍。可能因为单独过表达dxs导致MEP积累，积累后需过表达dxr才能在随后的步骤中转化，因此这两个基因的过表达使MEP途径的碳通量增加。将dxs、dxr和idi一起共过表达时，MK-7的产量反而下降了3倍。这很令人诧异，推测idi过表达后使碳通量增加到异戊二烯，减少了用于MK-7生物合成的碳。![]()
图3 过表达MEP通路后的生长曲线和产量
MK-7合成还依赖于MenA将类异戊二烯尾部与萘醌环连接。将menA添加到dxs-dxr-idi基因簇末端共同过表达，与仅过表达dxs-dxr-idi相比，MK-7产量增加了4.4倍。表明在产生过程中，上游MEP通路与下游存在“推拉”效应。由于合成的基因簇是由单个驱动的，理论上单个基因离启动子越近表达越强。将menA插入到Pspac启动子最前端，menA-dxs-dxr-idi基因簇结构能使MK-7的产量提高到50mg/L，比空载体提高11倍，这是迄今为止在芽孢杆菌系统中MK-7产量的最高倍增长。同时，基因簇menA-dxs-dxr-idi的产量比menA-dxs-dxr高1.3倍，说明只有在MenA充足时，过表达idi才会使下游IPP和DMAPP之间维持最佳比例。![]()
图4 共过表达MEP和menA时生长曲线和产量
对照和工程菌株的初始生长速率近似，但高产MK-7菌株稳定期时OD值均大幅下降，这与在气液界面形成生物膜(菌膜)絮凝有关。静态培养中能在气/液界面看菌膜形成，但摇动培养、纯载体或野生型菌株未见膜。在过量生产MK-7的菌株中，菌膜形成使细胞的疏水性增加，因为MK-7是一种脂溶性维生素，在水中难溶。在工业生物反应器中，膜的形成可能对监测、曝气和混合构成影响。另外，菌膜形成使生物质从培养上清中容易分离，可能有利于产品回收。![]()
图5 培养中菌膜生物膜的形成
异戊二烯由DMAPP产生并有高挥发性，可通过GC-MS高灵敏分析，是MEP途径通量的理想报告物。在异戊二烯生产实验中，所有菌株OD值在48h时急剧下降，异戊二烯浓度在24~48h保持不变，此时MK-7浓度显著升高。与摇瓶结果相似，仅在48h时，过表达dxs-dxr-idi比dxs-dxr的菌株产生的MK-7更少，但两者产生的异戊二烯浓度相似，且过表达idi使MK-7/异戊二烯比值降低。menA过表达后又增加了异戊二烯和MK-7产量，并使MK-7/异戊二烯比值增加。总体而言，异戊二烯水平可能主要取决于IspH活性，在不同菌株间差异较小，不能很好的指示MEP的碳通量。![]()
图6 培养中细胞密度和异戊二烯及MK-7产量
最后使用质谱法测量细胞内中间代谢物，确定MEP途径的瓶颈。对含空载体和过表达menA-dxs-dxr-idi的最佳工程菌株的两个时间点进行代谢物分析。在3h指数早期的代谢水平相似，到120h稳定期后差异明显。DXP、MEP和MEcPP在工程菌中积累到较高水平，在空载体菌株中几乎没有。同时，工程菌中HMBPP、IPP/DMAPP和FPP没有积累，表明IspG是限速酶。由于上游代谢物DXP和MEP也有积累，进一步增强dxs和dxr表达以扩大途径通量可能是有益的。因此，进一步提高MK-7产量的下一个步骤应是IspG和IspH的共同过表达。![]()
图7 空载体和工程菌胞内中间代谢物谱
本研究通过将枯草芽孢杆菌MEP通路和menA基因过表达，优化重组基因顺序，成功提高了MK-7产量，最佳重组菌中浓度达到50mg/L，是亲本菌株的11倍。同时发现顶空异戊二烯是MEP通量的较差报告者，可根据胞内代谢物谱识别通路瓶颈。证明了枯草芽孢杆菌利用代谢工程技术生产MK-7或其他类异戊二烯产物的潜力。相关论文信息：
http://doi.org/10.1021/acssynbio.9b00077
枯草芽孢杆菌是食品、饲料安全菌种，具有易培养、高效表达（或分泌表达）蛋白等优势。淳瑶生物研发的MATE枯草表达系统，拥有多种“表达质粒-宿主菌种”搭配方案，针对不同类型目的蛋白进行胞内、胞外特异性优化，实现目的蛋白“高表达”（占总蛋白60%以上表达量，分泌胞外蛋白量超过80%），“高严谨”（可达790倍诱导倍数），和“耐葡萄糖”（20g/L葡萄糖条件下表达强度不变），并具有自主知识产权和发明专利群，可以广泛应用食品、饲料、医药等领域。
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