γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种生物聚合物，因其生物相容性、无毒性和可食用性而具有广泛的应用。低分子量γ-PGA在农业和医药领域具有广阔的应用前景。传统上由酶水解产生，产量低且成本较高，寻求低成本的生物生产对于商业应用至关重要。中国科学院微生物研究所王丽敏研究团队在Microbial Cell Factories上发表题为Efficient molasses utilization for low-molecular-weight poly-γ-glutamic acid production using a novel Bacillus subtilis stain的文章，分离并鉴定出一株产低分子量γ-PGA菌株枯草芽孢杆菌242，对碳源和氮源浓度优化后，在5L反应器中发酵生产γ-PGA，产量达到32.14g/L，产率0.67g/L/h，分子量为27.99kDa，谷氨酸百分产率106.39%。表明枯草芽孢杆菌242具有利用廉价副产物生产低分子量γ-PGA的潜力。![]()
首先进行菌株筛选，在谷氨酸琼脂平板上获得260株黏液菌。分别转入发酵培养基中，测得γ-PGA产量最高的菌株命名为枯草芽孢杆菌242，其16s rDNA基因序列与DSM10菌株相似度达99.93%。构建系统进化树发现菌株242与SBMP4形成一个簇，归类为枯草芽孢杆菌属，存放于中国通用微生物菌种保藏中心，注册号CGMCC NO.23791。以新分离的242菌株为原料，用葡萄糖和酵母提取物为碳氮源制备γ-PGA，凝胶渗透色谱法检测重均分子量为28.49kDa，表明该菌株是一个低分子量γ-PGA产生菌。
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图1 新分离菌株的鉴定和特征
多数芽孢杆菌产γ-PGA的分子量大于100kDa。γ-DL-谷氨酰水解酶(PgdS)是一种内切型水解酶，能裂解γ-谷氨酰键，使高分子量γ-PGA解聚为低分子量，因此是生产中控制分子量多少的关键酶。通过实时荧光定量PCR检测菌株242发酵6、12、24、24和36h时pgdS的转录水平，结果表明，12~6h的转录比为0.31±0.04，pgdS在发酵早期有高表达，这对分子量具有重要的调控作用，从而产生更低分子量的γ-PGA。![]()
图2 不同发酵时间pgdS相对转录水平
甘蔗糖蜜是制糖工业的主要副产品，含有约50%的糖和少量粗蛋白、灰分和金属离子。用HPLC检测了甘蔗糖蜜中的总糖，含395g/L蔗糖，3g/L葡萄糖和13g/L果糖。采用20g/L初始糖浓度进行摇瓶发酵，分别研究甘蔗糖蜜、蔗糖和葡萄糖对γ-PGA产量的影响。结果表明，用甘蔗糖蜜发酵的产量约10.67g/L，高于蔗糖的8.78g/L和葡萄糖9.57g/L。菌株OD值约为15.87，也高于蔗糖10.29和葡萄糖6.63。细胞密度高可能是产量高的原因之一。酵母提取物由碳水化合物、氨基酸、肽、维生素和微量元素组成。在甘蔗糖蜜中加入酵母提取物后发酵，γ-PGA浓度和谷氨酸的转化率显著增强。![]()
图3 采用不同碳源的γ-PGA产量
继续考察氮源的影响。在摇瓶发酵中加入2g/L酵母提取液，γ-PGA浓度从1.67g/L上升到约10.67g/L。此时谷氨酸产率最高，约为91.99%，进一步加大到5g/L对产量无影响。酵母提取液成本高昂是工业化的主要障碍。玉米浸渍液是湿磨工艺的副产品，含粗蛋白、氨基酸、维生素等营养物质。添加2g/L玉米浸渍液作为替代氮源，γ-PGA的相对浓度较酵母提取液提高了45.55%。选用不同浓度的甘蔗糖蜜制备γ-PGA。当低于100g/L时，增加浓度可以促进γ-PGA产生。在100g/L达到最高值39g/L。浓度继续增加后产量降低，可能是产生了金属离子等有毒化合物而抑制菌株生长。因此，选择100g/L甘蔗糖蜜进行发酵。![]()
图4 酵母提取物对γ-PGA产量的影响
最后在5L反应器中进行补料分批发酵。初始糖蜜浓度为100g/L，含总糖约40g/L，24h后以6mL/h的流速饲喂，使糖浓度保持在10g/L以下。谷氨酸初始浓度26g/L，34h后以2mL/h添加，浓度在5g/L以下。结果表明，0~24h培养液中有少量γ-PGA蓄积，24h后浓度逐渐升高，最终在50h达到最大32.24g/L（原文如此），产率0.67g/L/h，γ-PGA的重均分子量为27.99kDa。此外，谷氨酸的百分产率为106.39%，这由于TCA循环的内源性谷氨酸也用于前体，获得了高于100%的产率。![]()
图5 在5L反应器中发酵生产γ-PGA
本研究分离并鉴定出产低分子量γ-PGA的菌株枯草芽孢杆菌242。以甘蔗糖蜜为碳源，玉米浸渍液为氮源，在补料分批发酵下γ-PGA产量达到32.14g/L，分子量27.99 kDa，谷氨酸百分产率为106.39%。本研究为利用廉价工业副产品生产低分子量γ-PGA提供了一条可持续的经济途径。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1186/s12934-022-01867-5
枯草芽孢杆菌是食品、饲料安全菌种，具有易培养、高效表达（或分泌表达）蛋白等优势。淳瑶生物研发的MATE枯草表达系统，拥有多种“表达质粒-宿主菌种”搭配方案，针对不同类型目的蛋白进行胞内、胞外特异性优化，实现目的蛋白“高表达”（占总蛋白60%以上表达量，分泌胞外蛋白量超过80%），“高严谨”（可达790倍诱导倍数），和“耐葡萄糖”（20g/L葡萄糖条件下表达强度不变），并具有自主知识产权和发明专利群，可以广泛应用食品、饲料、医药等领域。
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