γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由D/L-谷氨酸单体通过氨基和羧基间的γ-酰胺键连接而形成的天然阴离子聚合物，具有高吸水性、可食用、可生物降解等特征，广泛用于农业、化妆品、医疗、食品和废水净化等各个领域。华东理工大学赵黎明和范立强研究团队在Applied Biochemistry and Biotechnology上发表题为Enhanced Low Molecular Weight Poly-γ-Glutamic Acid Production in Recombinant Bacillus subtilis 1A751 with Zinc Ion的文章，构建了一株含合成酶基因簇pgsBCAE的重组枯草芽孢杆菌，具有合成约10kDa低分子量γ-PGA的能力，并且过量谷氨酸会抑制，而添加锌离子可以增强pgsB转录促进合成，且对分子量无影响。优化条件后，重组菌的γ-PGA产量由0.54g/L提高到3.9g/L，谷氨酸转化率达到78%，为目前报道的先进水平。![]()
γ-PGA的生物合成非核糖体依赖，由PgsB、PgsA、PgsC和PgsE四种关键蛋白参与。PgsB是γ-酰胺连接酶，PgsA负责PGA的转运，PgsC连接PgsB和PgsA，PgsE为调节蛋白。在前期研究中，鉴定了一株产γ-PGA的枯草芽孢杆菌ECUST。首先将其合成酶基因簇pgsBCAE构建到载体pBNS2上，以枯草芽孢杆菌基因组为模板，使用正反向引物扩增，目的基因大小约3kb。经双酶切和纯化后，与pBNS2连接并转入大肠杆菌。阳性克隆通过PCR和双酶切消化鉴定。质粒测序显示，枯草芽孢杆菌ECUST的pgsBCAE基因与GXA-28菌株的同源性达99%。![]()
图1 质粒pBNS2-pgsBCAE的构建
接着将阳性菌株提取质粒并转入枯草芽孢杆菌1A751中。将重组菌株和只含空载体的对照菌株进行发酵，菌株在前24h的γ-PGA产量迅速增加，随后下降，64h时滴度达到0.54g/L。对照菌产量仅约0.04g/L。表明pgsBCAE被成功表达，同时在胞外发酵液中也检测到γ-PGA。随后在培养基中添加各种金属离子，其中Zn2+的效果最好。在含20g/L谷氨酸培养基中加入0~0.6mM硫酸锌，γ-PGA随添加量的增加而增加。添加0.6mM时，γ-PGA产量最高达到1.93g/L，是未添加的3.57倍，但产率没有明显增加。添加前后γ-PGA的分子量均为10kDa，没有影响。![]()
图2 重组菌发酵生产γ-PGA并验证
随后研究谷氨酸浓度对表达的影响。在没有谷氨酸时，重组菌只形成约0.145g/L的少量γ-PGA。加入5g/L谷氨酸时，产量上升到1.04g/L，是不添加的7.2倍。继续增大谷氨酸浓度后，生物量也随之增大，但γ-PGA的产量反而下降。因此5g/L谷氨酸是最佳浓度，过量后可能抑制pgsBCAE表达或抑制谷氨酸合成酶活性。![]()
图3 添加谷氨酸对产量和生物量的影响
通过半定量RT-PCR分析重组菌中γ-PGA合成酶各基因的转录水平，探讨Zn2+提高产量的影响机制。加入0.6mM硫酸锌后的重组菌中pgsB、pgsC、pgsA和pgsE的表达量分别是未添加的1.73、1.1、0.85和0.62倍。这表明Zn2+主要增强了pgsB基因的表达，进而增加了产量。最后在5g/L谷氨酸培养基中改变锌离子浓度，重组菌γ-PGA产量最高为3.9g/L，是初始的7.22倍，谷氨酸转化率达到78%。![]()
图4 锌离子增强合成关键基因转录水平
本研究在枯草芽孢杆菌1A751中成功克隆并表达了编码γ-PGA合成酶的pgsBCAE基因簇。重组菌具有合成γ-PGA的能力，分子量约10kDa。添加外源谷氨酸和锌能促进合成，且不影响分子量。最终γ-PGA的产量和谷氨酸转化率分别达到3.9g/L和78%，为国内外报道的先进水平，该重组枯草芽孢杆菌具有工业化生产低分子量γ-PGA的潜力。相关论文信息：
https://doi.org/10.1007/s12010-019-03004-2
枯草芽孢杆菌是食品、饲料安全菌种，具有易培养、高效表达（或分泌表达）蛋白等优势。淳瑶生物研发的MATE枯草表达系统，拥有多种“表达质粒-宿主菌种”搭配方案，针对不同类型目的蛋白进行胞内、胞外特异性优化，实现目的蛋白“高表达”（占总蛋白60%以上表达量，分泌胞外蛋白量超过80%），“高严谨”（可达790倍诱导倍数），和“耐葡萄糖”（20g/L葡萄糖条件下表达强度不变），并具有自主知识产权和发明专利群，可以广泛应用食品、饲料、医药等领域。
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