尿酸酶是嘌呤降解途径中的一种酶，催化不溶性尿酸氧化降解为可溶的尿囊素，产生二氧化碳和过氧化氢，在临床上广泛用于血液和其他液中尿酸含量测定。人体内没有尿酸代谢系统，通过外用尿酸酶治疗高尿酸血症及相关疾病。印度希瓦吉大学Padma B. Dandge研究团队在Heliyon上发表题为Statistical media optimization for the production of clinical uricase from Bacillus subtilis strain SP6的文章，将分离到一株尿酸酶高产菌株鉴定为枯草芽孢杆菌SP6，采用响应面法优化培养基，乳糖、大豆蛋白胨、尿酸和硫酸亚铁是影响产量的关键。以中心复合设计推导出最优成分为乳糖12.2g/L、大豆蛋白胨12.79g/L、尿酸2.55g/L和硫酸亚铁0.00325g/L，尿酸酶产量达到15.87U/mL，提高了13.23倍，同时验证了该模型对优化的有效性。![]()
首先筛选和鉴定最强菌株，将1g家禽粪便样品加入到最小液体培养基中，37℃静置48h后，将混浊肉汤在含2.5g/L尿酸和28g/L琼脂的尿酸琼脂板上划线，37℃下再孵育48h，有清除带的分离菌落为产尿酸酶菌落。最终分离出25株产尿酸酶菌株，其中SP6菌株在接种点最短时间内显示出更大的清除区，是尿酸酶产量最大菌株。![]()
图1 高产尿酸酶的细菌分离株
接着对菌株鉴定及系统发育分析。经16S rDNA测序，确定菌株为枯草芽孢杆菌SP6，与枯草芽孢杆菌序列相似性为99%。采用MEGA 7软件进行系统发育分析，最大似然法构建分子系统发育树。![]()
图2 基于16S rDNA的分子系统发育分析
随后进行单次单因素培养基优化。最直接的方法是改变碳氮源。碳源方面，羧甲基纤维素、葡萄糖、果糖、乳糖和淀粉都使尿酸酶产量有所提高，其中乳糖的增幅最大，有5.5U/mL，其次是葡萄糖4.8U/mL。![]()
图3 不同碳源对尿酸酶产量的影响
氮源方面，在1%水平下大多数有机氮源显著提高了尿酸酶产量，但几乎所有无机氮源均小幅度降低了产量。大豆蛋白胨是最佳的氮源，其次是牛肉提取物，而硝酸钠、尿素和甘氨酸大大降低了酶的产量。![]()
图4 不同氮源对尿酸酶产量的影响
再通过Plackett Burman设计筛选显著因素，选择了9个变量，检验它们对尿酸酶产量的影响。统计分析表明，乳糖、大豆蛋白胨、尿酸和七水硫酸亚铁显著影响尿酸酶的产生，其他成分如磷酸氢二钾、硝酸铵、七水硫酸镁和NaCl无显著性。通过回归分析，得到将尿酸酶产量表示为自变量的一阶多项式方程：R=4.32+1.01A+1.15B+1.18C-0.4125D。模型F值为30.88，p值小于0.05，具有显著性。重要变量间相互依赖关系可能无法用一阶方程说明，在响应面试验中通过二阶模型进一步研究。![]()
图5 帕累托图中影响尿酸酶产量关键成分
最后对重要组分进行中心复合设计进一步优化。方差分析后得到的回归方程显示尿酸酶生成水平是乳糖、大豆蛋白胨、尿酸和硫酸亚铁等变量的函数。验证模型是显著的，并具有充分性。乳糖和大豆蛋白胨的交互作用图为圆形，表明二者无显著相互作用。乳糖和尿酸的图近椭圆形，表明有中等影响，而乳糖和硫酸亚铁是椭圆形，表明有显著影响。同样，尿酸和大豆蛋白胨的相互作用有中等影响。大豆蛋白胨与硫酸亚铁，尿酸与硫酸亚铁的相互作用都有显著影响。模型验证后，推荐尿酸酶高产培养基浓度为：乳糖12.2g/L，大豆蛋白胨12.79g/L，尿酸2.55 g/L和0.00325g/L硫酸亚铁，得到枯草芽孢杆菌SP6产尿酸酶量为15.87U/mL。![]()
图6 中心复合设计显示各组分的相互作用
本研究分离并鉴定了一株高产尿酸酶的枯草芽孢杆菌SP6。采用响应面法确定了乳糖、大豆蛋白胨、尿酸和七水硫酸亚铁为影响产量的关键因子，采用中心复合设计对培养基组分进行优化，使尿酸酶产量达到15.87U/mL，比初始培养基提高13.23倍。枯草芽孢杆菌SP6菌株是迄今为止产尿酸酶能力最强的细菌。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2019.e01756
枯草芽孢杆菌是食品、饲料安全菌种，具有易培养、高效表达（或分泌表达）蛋白等优势。淳瑶生物研发的MATE枯草表达系统，拥有多种“表达质粒-宿主菌种”搭配方案，针对不同类型目的蛋白进行胞内、胞外特异性优化，实现目的蛋白“高表达”（占总蛋白60%以上表达量，分泌胞外蛋白量超过80%），“高严谨”（可达790倍诱导倍数），和“耐葡萄糖”（20g/L葡萄糖条件下表达强度不变），并具有自主知识产权和发明专利群，可以广泛应用食品、饲料、医药等领域。
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